Valutazione dell'espressione di PRDI-BF1 e dell'isoforma beta di PRDI-BF1 in pazienti in trattamento chemioterapico per Mieloma Multiplo

Valutazione dell'espressione di PRDI-BF1 e dell'isoforma beta di PRDI-BF1 in pazienti in trattamento chemioterapico per Mieloma Multiplo. Human Positive Regulatory Domain I Binding Factor 1 (PRDI-BF1 o Blimp-1) è un fattore di trascrizione cruciale per la genesi e la sopravvivenza a lungo termine delle plasmacellule. PRDI-BF1, guidando lo switch dei linfociti B maturi a plasmacellule, ha come bersaglio numerosi geni coinvolti nella maturazione dei linfociti B. Il gene PRDM1, che codifica per PRDI-BF1, contiene un promotore alternativo in grado di generare un’isoforma tronca (PRDI-BF1 beta). L’isoforma beta è stata riscontrata in quantità considerevoli soprattutto in linee cellulari di Mieloma Multiplo (MM) e la sua funzione rimane ancora da chiarire. Blimp-1 lega e trans-attiva sequenze specifiche come CS1, iper-espresso nelle cellule mielomatose, e ciò potrebbe esser d’aiuto nel chiarire la specifica funzione di nuovi farmaci come elotuzumab che blocca selettivamente CS1. Inoltre, l’interruzione dei pathway regolatori di Blimp-1 e Aiolos, quest’ultimo fattore trascrizionale anti-apoptotico delle cellule mielomatose che co-opera con Blimp-1, contribuisce all’attività anti-MM della lenalidomide. Pertanto, abbiamo condotto uno studio al fine di indagare la differente espressione di Blimp-1/PRDI-BF1 e della sua isoforma beta durante l’evoluzione clinica e il trattamento dei pazienti affetti da MM. Sono stati arruolati nel nostro dipartimento 26 pazienti affetti da MM e 3 soggetti sani. Undici pazienti sono ancora in trattamento e quindi con un follow-up troppo breve. Pertanto ci siamo concentrati principalmente su 15 pazienti di cui erano già fruibili due o più controlli nel tempo. Di questi ultimi pazienti, disponevamo di almeno due prelievi crio-preservati di sangue midollare intero, per un totale di 64 determinazioni. In particolare, sei pazienti sono stati precedentemente trattati con regime di induzione VTD e trapianto di cellule staminali autologhe (ASCT), in seguito hanno ottenuto almeno una VGPR (Very Good Partial Response) ed erano stati avviati a follow-up clinico periodico (Gruppo Stable Disease). Quattro pazienti, hanno ottenuto almeno una risposta parziale (PR) dopo il regime d’induzione (Gruppo Responders) ed i rimanenti cinque pazienti (Gruppo Non Responders/Progressive Disease, PD) hanno sviluppato una recidiva o non hanno ottenuto risposta al trattamento tra il primo ed il secondo prelievo. Tutti i pazienti hanno letto e firmato un consenso informato e, in accordo con la dichiarazione di Helsinki, sono stati sottoposti a biopsia osteo-midollare e aspirato midollare per analizzare campioni di sangue midollare a due diversi time-point. In dettaglio, i campioni dei 6 pazienti in follow-up e in VGPR sono stati presi a 6 mesi di distanza durante il periodo di controllo, i campioni dei 4 pazienti alla diagnosi sono stati raccolti prima dell’inizio del ciclo d’induzione e dopo 1 mese dal termine dello stesso. Infine, i campioni degli ultimi 5 pazienti sono stati analizzati al momento della progressione e 1 mese dopo la terapia di salvataggio. L’RNA totale è stato estratto e retro-trascritto dal sangue midollare mediante isolamento dell’RNA e specifici kit di trascrizione ed è stata eseguita un’analisi mediante Real Time Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR) di entrambi i fattori di trascrizione con due diversi primers oligonucleotidici, uno in grado di riconoscere entrambe le isoforme α- e beta-PRDI-BF1 e l’altro solo l’isoforma beta. I valori quantitativi sono stati calcolati utilizzando il metodo 2-ΔΔCt. Dai risultati emerge che PRDI-BF1 e PRDI-BF1beta erano entrambi espressi ad un livello considerevole in tutti i campioni analizzati. L’espressione media totale di PRDI-BF1 e dell’isoforma beta in tutti i pazienti affetti da MM, comparata all’espressione media totale nella popolazione sana di controllo, risulta nettamente aumentata. Inoltre, l’espressione media dei trascritti correla con lo stato di malattia (Complete Response/VGPR, PR o PD) ed altrettanto con l’infiltrazione midollare di malattia (<10%, 10-59% o ≥60%) in ciascuna della 64 determinazioni. Inoltre, anche nei tre gruppi descritti l’espressione media di PRDI-BF1 e dell’isoforma beta ai due (o tre) time-point, riflette lo stato di malattia. Nei pazienti del Gruppo Responders, l’espressione di PRDI-BF1 e della sua isoforma beta mostra un trend in netta diminuzione nell’espressione dei due trascritti al diminuire della quantità di malattia. Nei pazienti del Gruppo Non Responders/Progressive Disease, invece, l’espressione dei due trascritti mostra un trend in netto incremento, all’aumentare della quantità di malattia. Infine, nei pazienti del Gruppo Stable Disease, l’espressione dei trascritti dal 1° tp al 2° tp aumenta, seppur in modo assai contenuto, in condizioni di apparente stabilità clinica di malattia. Si osserva un possibile cut-off pari a 5,00 volte (NFE, Normalized Fold Expression) di aumento dei trascritti rispetto ai valori nei controlli sani evidente. Dunque, un aumento dei trascritti superiore a 5 volte potrebbe corrispondere ad una maggior probabilità di sviluppare una recidiva precoce di malattia. È un’ipotesi che deve essere ulteriormente validata. Questi risultati confermano quanto finora noto in letteratura e suggeriscono che i due trascritti correlano con lo stato di malattia, con la differente risposta al trattamento e con la quantità di malattia. Altresì, suggeriscono diverse possibili applicazioni di PRDI-BF1, come marcatore di risposta e di conseguenza come parametro di follow-up e di prognosi della malattia stessa

Neuroprotective effects of thymoquinone by the modulation of ER stress and apoptotic pathway in in vitro model of excitotoxicity.

Experimental evidence indicates that the activation of ionotropic glutamate receptors plays an important role in neurological disorders’ models such as epilepsy, cerebral ischemia and trauma. The glutamate receptor agonist kainic acid (KA) induces seizures and excitotoxic cell death in the CA3 region of the hippocampus. Thymoquinone (TQ) is the most important component of the essential oil obtained from black cumin (Nigella sativa L.) seeds. It has many pharmacological actions including antioxidant, anti-inflammatory, and anti-apoptotic effects. TQ was used in an in vitro experimental model of primary cultures where excitotoxicity was induced. Briefly, rat organotypic hippocampal slices were exposed to 5 µM KA for 24 h. Cell death in the CA3 subregions of slices was quantified by measuring propidium iodide fluorescence. The cross-talk between TQ, ER stress and apoptotic pathways was investigated by Western blot. In untreated slices TQ (10 µM) induced a significant increase on the PSD95 levels and it decreased the excitotoxic injury induced by KA. Additionally, TQ was able to ameliorate the KA-induced increase in unfolded proteins GRP78 and GRP94 expression. Finally, TQ was able to partially rescue the reduction of the KA-induced apoptotic pathway activation. Our results suggest that TQ modulates the processes leading to post-kainate neuronal death in the CA3 hippocampal area

PRDI-BF1 and PRDI-BF1P isoform expressions correlate with disease status in multiple myeloma patients

Human positive regulatory domain I binding factor 1 (PRDI-BF1 or BLIMP-1) is a transcription factor that acts as a master regulator and has crucial roles in the control of differentiation and in maintaining survival of plasma cells (PC). The PRDM1 gene, which codifies for PRDI-BF1, contains an alternative promoter capable of generating a PRDI-BF1 deleted protein (called PRDI-BF1β), which lacks 101 amino acids comprising most of the regulatory domain. PRDI-BF1β has been detected in relevant quantities especially in multiple myeloma cell lines (U266 and NCI- H929). The first aim of the study was to compare, using real time polymerase chain reaction (RT-PCR), the levels of PRDI-BF1 and PRDI-BF1β in myeloma patients and in normal human bone marrow. The second step was the examination of the expression of PRDI-BF1 and PRDI-BF1β isoform depending on disease status and treatment response. We demonstrate the correlation of PRDI-BF1 and the shorter PRDI-BF1β isoform protein levels with the clinical evolution and the management of myeloma patients

Delivery Mode Shapes the Composition of the Lower Airways Microbiota in Newborns

Radical alterations in the human microbiota composition are well-known to be associated with many pathological conditions. If these aberrations are established at the time of birth, the risk of developing correlated pathologies throughout life is significantly increased. For this reason, all newborns should begin their lives with a proper microbiota in each body district. The present study aimed at demonstrating a correlation between the mode of delivery and the development of a well-balanced microbiota in the lower airways of newborns. 44 pregnant women were enrolled in this study. Microbiological comparative analysis was carried out on tracheobronchial secretions of babies born through vaginal delivery (VD) or caesarean section (CS). All samples showed the presence of bacterial DNA, regardless of the mode of delivery. No viable cultivable bacteria were isolated from the CS samples. On the contrary, VD allowed colonization of the lower airways by alive cultivable bacteria. The identification of bacterial species revealed that Lactobacillus spp. and Bacteroides vulgatus were the most common microorganisms in the lower airways of vaginally-delivered newborns. Data obtained from quantitative PCRs showed a significantly higher total bacterial load, as well as Firmicutes and Lactobacillus spp. amount, in VD samples than CS ones, while no statistically significant difference was found in Torque Teno Virus (TTV) load between samples. Taken together, our findings confirm the hypothesis that passage through the maternal vaginal canal determines more beneficial colonization of the lower airways in newborns

Impact of different chemotherapy regimens on intestinal mucosal injury assessed with bedside ultrasound: a study in 213 AML patients

IntroductionNeutropenic enterocolitis (NEC) is a life-threatening complication reported in patients with acute myeloid leukemia (AML) following chemotherapy (CHT). Intensive induction and consolidation CHT may damage intestinal mucosa leading to a NEC episode (NECe). NEC reported mortality may be up to 30-60%. Early US-guided bed-side diagnosis and prompt treatment may substantially improve the survival. An emerging worldwide concern is the intestinal colonization by multi-drug-resistant bacteria especially when patients are exposed to chemotherapy regimens potentially correlated to mucosal damage. MethodsIn our study we prospectively enrolled all AML patients admitted in our leukemia unit to receive intensive induction and consolidation chemotherapy and experiencing chemotherapy-induced-neutropenia (CHTN). Results and discussionOverall, we enrolled N=213 patients from 2007 to March 2023. We recorded N=465 CHTN, and N=42 NECe (9.0% incidence). The aim of our study was to assess which chemotherapy regimens are more associated with NEC. We found that ALM1310, followed by 7 + 3 (daunorubicin), 7 + 3 (idarubicin), 5 + 3 + 3 (cytarabine, etoposide, idarubicin), and AML1310 (consolidation) were associated with a statistically higher incidence of NEC. We did not detect NEC episodes in patients treated with CPX-351, 5 + 2 (cytarabine, idarubicine), and high-dose cytarabine. Thus, we found that cytarabine could determine mucosal damage when associated with an anthracycline but not if delivered either alone or as dual-drug liposomal encapsulation of daunorubicin/cytarabine. We also describe NEC mortality, symptoms at diagnosis, intestinal sites involvement, and prognostic significance of bowel wall thickening

Leucemie acute mieloidi: la malattia residua misurabile oggi

La leucemia mieloide acuta (in sigla LMA) è una patologia oncoematologica caratterizzata dalla proliferazione di progenitori mieloidi clonali patologici, detti blasti, e determinata dall’accumulo di multiple mutazioni somatiche del genoma. Nonostante l’eterogeneità molecolare, l’iter diagnostico e terapeutico è ad oggi definito da ben precisi marker immunofenotipici, di biologia-molecolare e di citogenetica e sulle valutazioni della remissione di malattia in corso di trattamento. La remissione completa di malattia (in sigla RC) è definita, a livello morfologico e citofluorimetrico, dalla presenza di una percentuale inferiore al 5% di blasti mieloidi e, a livello citogenetico e molecolare, dall’assenza delle mutazioni identificate alla diagnosi. La valutazione della malattia minima residua (in sigla MMR) è un importante fattore prognostico alla diagnosi ed in corso e post-trattamento. Tale riscontro può avvenire, ove possibile, con metodiche citofluorimetriche, citogenetiche e di biologia-molecolare. L’obiettivo di questo studio è proprio l’analisi del ruolo prognostico della MMR, in termini di sopravvivenza globale (in sigla OS) e sopravvivenza libera da malattia (in sigla PFS), nei pazienti affetti da LMA su di una coorte di pazienti appartenenti alla casistica pisana delle LMA risalenti al periodo degli ultimi 10 anni. Dal nostro studio è emerso il ruolo cruciale delle indagini di biologia-molecolare nella determinazione dell’MMR. In particolare, tra i marker più studiati ed annoverati anche nelle più recenti linee guida internazionali, ci siamo concentrati sullo studio della ricerca delle mutazioni di FLT3, in particolare della cosiddetta internal tandem duplication (ITD), della ricerca della mutazione del gene codificante per la nucleofosmina (NPM1), della traslocazione AML1/ETO (RUN1/RUNX1T1) e della traslocazione CBFB-MYH11 (altresì detta inversione del cromosoma 16), oltre a approfondire il ruolo dei livelli di espressione del gene WT1. Tra le suddette, la presenza di NPM1, di AML1/ETO o di CBFB-MYH11, caratterizza delle entità a sé di sottotipi di leucemia acuta mieloide accomunate dal fatto di essere a rischio prognostico favorevole (low-risk). Inoltre, la persistenza di MMR di biologia-molecolare, eseguibile mediante determinazione quantitativa di NPM1, fornisce una valutazione prognostica accurata ed indipendente rispetto ad altri fattori di rischio e permette l’attuazione di strategie terapeutiche cosiddette “di consolidamento” adattate al rischio della patologia stessa. Di alcune delle suddette mutazioni e traslocazioni, nella nostra casistica, abbiamo indagato dettagliatamente l’espressione o meno alla diagnosi e l’espressione quantitativa delle stesse, ove possibile, durante tutte le principali fasi dell’iter terapeutico; infine, abbiamo valutato la potenziale utilità del monitoraggio del dosaggio quantitativo di WT1 in correlazione allo stadio di malattia quale possibile indicatore prognostico e per valutare se potesse anche avere un valore di predittività precoce di recidiva di malattia

Neuronal and Astrocytic Morphological Alterations Driven by Prolonged Exposure with &Delta;9-Tetrahydrocannabinol but Not Cannabidiol

Cannabis derivatives are largely used in the general population for recreational and medical purposes, with the highest prevalence among adolescents, but chronic use and abuse has raised medical concerns. We investigated the prolonged effects of &Delta;9-tetrahydrocannabinol (THC) and cannabidiol (CBD) in organotypic hippocampal slices from P7 rats cultured for 2 weeks. Cell death in the CA1 subregion of slices was quantified by propidium iodide (PI) fluorescence, pre-synaptic and post-synaptic marker proteins were analysed by Western blotting and neurodegeneration and astrocytic alterations by NeuN and GFAP by immunofluorescence and confocal laser microscopy. The statistical significance of differences was analysed using ANOVA with a post hoc Dunnett w-test (PI fluorescence intensities and Western blots) or Newman&ndash;Keuls (immunohistochemistry data) for multiple comparisons. A probability value (P) of &lt; 0.05 was considered significant. Prolonged (72 h) THC or CBD incubation did not induce cell death but caused modifications in the expression of synaptic proteins and morphological alterations in neurons and astrocytes. In particular, the expression of PSD95 was reduced following incubation for 72 h with THC and was increased following incubation with CBD. THC for 72 h caused disorganisation of CA1 stratum pyramidalis (SP) and complex morphological modifications in a significant number of pyramidal neurons and in astrocytes. Our results suggest that THC or CBD prolonged exposure induce different effects in the hippocampus. In particular, 72 h of THC exposure induced neuronal and glia alterations that must draw our attention to the effects that relatively prolonged use might cause, especially in adolescents