Regulation of DII4 expression in cells committing to differentiation in the V2 domain of the developing spinal cord

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011During spinal cord (SC) embryonic development, several excitatory and inhibitory interneurons (INs) are generated but the molecular mechanisms underlying such cell diversity remain poorly understood. One of the mechanisms that has been involved in the generation of neuronal diversity is the cell-cell signalling mediated by the Notch pathway. Particular attention has been given to the V2 domain of SC since: i) instead of one ligand (as observed in the remaining domains), two Notch ligands (Delta-like 1 and Delta-like 4) are expressed and ii) three molecularly distinct subtypes of INs, V2a, V2b and V2c, are generated from apparently common progenitors. How Delta-like 4 (Dll4) expression is regulated and how IN specification is controlled in the V2 domain are the main focus of this thesis. To address these questions, the chick embryo was used as model organism. Using available databases and bioinformatics tools, we compared chick and mouse Dll4 promoter sequences. We identified preferred E-boxes for the binding of Mash1 and Neurogenins, two of the main proneural bHLH proteins, predicting that these proteins may regulate Dll4 expression. To test this hypothesis, we overexpressed Mash1, NGN1 and NGN2 in the chick developing SC. We show that Mash1 and NGN1 are able to activate Dll4 expression whereas NGN2 is not. As proneural proteins are involved in IN specification, we analysed the number of V2a INs after overexpressing these proteins. We show that while Mash1 represses V2a IN fate, NGN1 and NGN2 promote this fate. Moreover, as HES proteins (another bHLH protein family member) have been shown to bind to E-boxes, we tested if HES6-2 could regulate Dll4 expression and found that it might act as a repressor of Dll4. To further investigate how Dll4 expression is regulated, we generated a fluorescent reporter using the 3310bp sequence localized upstream of the Dll4 coding region as a promoter sequence. This reporter failed to reflect endogenous Dll4 expression, indicating that for the accurate expression of Dll4, there must be essential regulatory sequences outside the 3310bp upstream of the Dll4 coding region. This thesis presents new evidences on how Dll4 expression can be regulated by different proneural proteins and HES6-2 protein and what may be their contribution to V2 interneuron specification. This study provides new insights on how neurogenesis is controlled in the V2 domain of the developing SC.O Sistema Nervoso Central é um sistema muito complexo sendo constituído por um grande número e variedade de células - neurónios e células da glia - as quais são, na sua grande maioria, produzidas durante o desenvolvimento embrionário. Estas células têm de ser geradas no momento e posição correctos, de forma a interagirem entre si e a formarem circuitos funcionais. Durante o desenvolvimento da espinal medula, um grande número de interneurónios excitatórios e inibitórios são gerados, mas os mecanismos moleculares subjacentes a esta diversidade celular são ainda pouco conhecidos. No entanto, sabe-se que a via de sinalização Notch desempenha um papel essencial durante o desenvolvimento do Sistema Nervoso Central. A via de sinalização Notch é um sistema de comunicação célula-a-célula que ocorre através do contacto directo entre duas proteínas membranares: o receptor Notch e os seus ligandos (Delta ou Serrate). Quando um ligando de uma célula interage com o receptor de outra célula desencadeia uma série de clivagens proteolíticas que levam à libertação do domínio intracelular do receptor Notch (NICD). O NICD é translocado para o núcleo onde se associa a outros factores (CSL e Mastermind) para activar a expressão de genes alvo, como os genes Hes. Na ausência de NICD, a proteína CSL actua como repressor transcricional dos mesmos genes. Actualmente, a função melhor caracterizada da via de sinalização Notch é a manutenção de progenitores neurais durante a neurogénese. A decisão de uma célula permanecer como progenitor ou diferenciar é controlada pelo balanço de dois tipos de factores de transcrição: proteínas proneurais, que promovem a diferenciação, ou proteínas HES, que reprimem a diferenciação neural. Uma célula ao expressar elevados níveis de proteínas proneurais vai iniciar o processo de diferenciação. Como estas proteínas activam a expressão de ligandos Notch, esta célula vai expressar elevados níveis de ligandos e vai activar a via Notch nas células vizinhas. Como consequência da activação desta via, estas células vão expressar elevados níveis de proteínas HES e vão permanecer como progenitores. Desta forma, a célula que expressa o ligando Notch diferencia-se em neurónio mas simultaneamente assegura que as células vizinhas se mantenham como progenitores. Visto que a neurogénese ocorre durante uma larga janela temporal, a manutenção de uma população de progenitores permite que estas células sejam expostas a diferentes estímulos e, como tal, diferenciem em diferentes neurónios durante o desenvolvimento. Evidências recentes mostram que a via Notch está também envolvida na especificação de células neurais, nomeadamente na especificação de interneurónios no domínio V2 da espinal medula. Neste domínio, três interneurónios, V2a, V2b e V2c, são produzidos a partir de progenitores comuns. Na ausência de sinalização Notch, apenas os interneurónios V2a são produzidos, o que indica que a sinalização Notch é necessária para a produção dos interneurónios V2b (os interneurónios V2c foram identificados recentemente e, como tal, não existem muitos dados disponíveis sobre esta linhagem). Curiosamente, nesta fase do desenvolvimento, este é o único domínio onde se sabe que diferentes interneurónios são simultaneamente produzidos e o único domínio onde dois ligandos da via Notch são expressos: Delta-like 1 (DLL1) e Delta-like 4 (DLL4). Pensa-se que o ligando DLL1 esteja envolvido na activação da via Notch e consequente manutenção de progenitores, enquanto o ligando DLL4 estará provavelmente envolvido na especificação dos interneurónios. Como é que a expressão de Dll4 é regulada no domínio V2 da espinal medula e como é que a especificação de interneurónios é controlada neste domínio são os principais temas investigados nesta tese. O organismo modelo utilizado para estudar estas questões foi o embrião de galinha. Recorrendo à técnica de hibridação in situ, mapeámos a expressão de Dll4 na espinal medula durante o desenvolvimento embrionário da galinha. O mRNA deste gene não foi detectado em células neurais da espinal medula no dia embrionário 2 (E2) nem no E3. No entanto, foi detectado no E4 na zona ventricular do domínio V2. Inesperadamente, observámos expressão de Dll4 em vários domínios dorsais e ventrais no E6, o que sugere que este ligando poderá estar envolvido na manutenção de progenitores ou na especificação de interneurónios produzidos mais tarde no desenvolvimento embrionário da galinha. Visto que as sequências importantes para a regulação da expressão de um gene tendem a ser conservadas entre diferentes espécies, utilizámos ferramentas bioinformáticas e bases de dados disponíveis para comparar as sequências do promotor do gene Dll4 de ratinho e galinha. Esta análise revelou que o nível total de semelhança destas sequências entre as duas espécies é baixo, tendo sido apenas possível identificar 5 regiões com semelhança superior a 60%. Nestas regiões conservadas foram identificadas E-boxes, sequências consenso às quais se ligam proteínas proneurais e proteínas HES. Uma análise mais detalhada permitiu identificar sequências consenso específicas para a ligação das proteínas proneurais Mash1 e Neurogeninas (NGN), o que sugere que estas proteínas possam estar directamente implicadas na regulação da expressão de Dll4. Para testar esta hipótese, as proteínas Mash1, NGN1 e NGN2 foram sobre-expressas na espinal medula de embriões de galinha no estádio HH17-18 pela electroporação in ovo de plasmídeos que codificam estas proteínas. Utilizando a técnica de hibridação in situ foi possível observar que tanto Mash1 como NGN1 promovem a expressão ectópica de Dll4 e, como tal, regulam positivamente a sua expressão. No entanto, após a sobre-expressão de NGN2, não se verificou nenhuma alteração na expressão endógena de Dll4, indicando que esta proteína proneural não será um factor importante no controlo da expressão deste gene. Visto que as proteínas proneurais controlam a especificação de neurónios durante o desenvolvimento de Sistema Nervoso Central, analisámos se depois da sobre-expressão destas proteínas o número de interneurónios V2a produzidos é alterado. Após a sobre-expressão de Mash1, observámos uma diminuição no número de interneurónios V2a, indicando que Mash1 reprime, directa ou indirectamente, a produção destes interneurónios. Contrariamente, observámos que, após a sobre-expressão de NGN1 e NGN2, o número de interneurónios V2a aumenta, o que sugere que as proteínas NGN1 e NGN2 promovem directamente a diferenciação de interneurónios V2a. As proteínas HES também se ligam a E-boxes e, como tal, podem estar envolvidas na regulação da expressão de Dll4. Visto que a proteína HES6-2 actua como repressor negativo da via Notch e é expressa ao longo do eixo dorso-ventral da espinal medula, esta proteína pode estar envolvida na regulação da expressão de Dll4 impedindo a sua expressão não só fora do domínio V2 no E4, mas também nos interneurónios V2b. A proteína HES6-2 contém um domínio repressor (WRPW) responsável pela sua actividade repressora. Para testar se esta proteína funciona como repressor transcricional do gene Dll4, utilizámos uma forma dominante negativa, na qual o domínio repressor WRPW foi substituído por um domínio transactivador - VP16. Esta proteína (HES6-2:VP16), em vez de reprimir, activa a transcrição dos genes alvo. HES6-2:VP16 foi sobre-expressa na espinal medula de galinha no estádio H17-18 pela electroporação in ovo de um plasmídeo que codifica esta proteína. Utilizando a técnica de hibridação in situ, observámos expressão ectópica de Dll4, indicando que a proteína HES6-2 reconhece o promotor deste gene e regula negativamente a sua expressão. Paralelamente, gerámos um repórter fluorescente da expressão de Dll4. No entanto, utilizando a sequência de 3310pb localizada a montante da região codificante do gene Dll4 de galinha como sequência promotora, não conseguimos gerar um repórter cuja expressão do gene repórter (Venus) reflicta a expressão endógena do gene Dll4. Como tal, poderão existir sequências regulatórias necessárias para a correcta expressão de Dll4 (nos estádios analisados) que não se encontram localizadas nos 3310pb a montante da região codificante deste gene. Sabe-se que as regiões regulatórias podem estar localizadas vários kb a montante do promoter, em intrões ou mesmo a jusante da região codificante. Como tal, é necessário fazer uma análise mais alargada do locus Dll4 para tentar identificar novas regiões conservadas que possam conter sequências regulatórias necessárias à correcta expressão do gene Dll4. Este estudo apresenta novas evidências sobre a função que diferentes proteínas proneurais e a proteína HES6-2 têm na regulação da expressão de Dll4 e na especificação de interneurónios no domínio V2. Estes resultados fornecem dados para uma futura análise detalhada de como a neurogénese se processa neste domínio

Determinantes do valor da marca na roupa exterior : marcas de fabricante-marcas de distribuidor

Dissertação de mestrado em Estratégia Empresarial, apresentada à Faculdade de Economia da Universidade de Coimbra

Toxicodependência no Feminino: perceções de consumidoras de substâncias a respeito do seu percurso

Dissertação apresentada à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Psicologia, ramo de Psicologia Clínica e da SaúdeO presente trabalho debruça-se sobre a problemática da toxicodependência no género feminino, mais especificamente sobre as trajetórias de vida e de desvio de mulheres dependentes de drogas. Para isso, questionou-se a eventual existência de particularidades biográficas frequentes entre consumidoras de substâncias. Averiguou-se também se mulheres com história de abuso de drogas apresentam similaridades relativamente ao seu percurso desviante. Adotou-se um desenho de estudo exploratório, descritivo, retrospetivo, transversal, observacional, baseado no método do inquérito e suportado pela técnica da entrevista. Os resultados obtidos numa amostra de 11 mulheres com história de consumo de substâncias, com uma média de 43 anos de idade (desvio padrão de 10.5), conduziram à conclusão de que estes indivíduos apresentam efetivamente regularidades ao nível do percurso biográfico, tendo-se desenvolvido num seio familiar problemático. A predominância de relações negativas, bem como a ausência de relações afetivas pode ter sido potenciadora da entrada no percurso desviante do consumo de substâncias. Destes resultados foi possível perceber claramente que há especificidades que se prendem com a questão do género no âmbito das toxicodependências, especificamente no percurso desviante das participantes neste estudo. Trata-se de uma área a estudar futuramente.This project focuses on the issues of drug addiction within the female gender, more specifically on the paths of life and deviation of women who are addicts. Therefore, we wondered about the existence of singular biographical traits common to different drug users. We also wondered if women who show an history of drug abuse share the same similar deviation patterns. For this, we adopted an exploratory, retrospective, transversal and observational method based on inquiry and supported by interviews. The results gathered from a sample of 11 women with a background of substance consumption, with an age average of 43 years, lead to the conclusion that these individuals do in fact present some similarities when it comes to their biographical journey, specially the fact that most of them grew up in troubled homes and broken families. The predominance of negative relationships as well as the absence of positive ones may have triggered their entry in the deviant path of drug use. From these results we were able to clearly state that there are specific issues that bind with the question of gender when it comes to substance addiction. It's definitely an area that requires more study

Perfilhamento de cultivares de Brachiaria Brizantha e Panicum Maximum em fase inicial de implantação.

bitstream/item/89804/1/BOP-24.pd

Relação do papel preditor dos estilos parentais com a invalidação e o impacto em termos de narcisismo em jovens adultos

Dissertação de Mestrado apresentada no ISP A – Instituto Universitário para obtenção de grau de Mestre na especialidade de Psicologia Clínica.Introdução. Uma das questões que permanece atual na literatura prende-se com as origens e causas do narcisismo. A investigação aponta para uma ligação entre a forma como a parentalidade é percebida e o narcisismo vulnerável e grandioso. No entanto, estudar só a expressão emocional dos pais isoladamente não é suficiente, sendo necessário perceber o impacto da invalidação emocional, que é especificamente focada numa reação dos pais à experiência interior do jovem. Objetivo. Estudar se os estilos parentais e as experiências de invalidação são preditores de narcisismo em jovens adultos. Método. O estudo contou com 375 participantes entre os 18 e os 30 anos, tendo como variáveis os estilos parentais, invalidação emocional, narcisismo vulnerável e narcisismo grandioso. Resultados. A invalidação emocional teve correlação com traços narcisistas vulneráveis de forma direta e indireta, observando-se uma mediação completa entre o estilo autoritário da mãe e o narcisismo vulnerável. Conjuntamente observou-se, para ambos os pais, uma mediação parcial na relação entre estilo permissivo e o narcisismo vulnerável. O mesmo aconteceu para o estilo autoritário do pai. Por outro lado, o estilo permissivo prediz o narcisismo grandioso, mas a invalidação não explica esta relação. Conclusão. As experiências de invalidação e os diferentes estilos parentais foram associados a traços mais elevados de narcisismo patológico em jovens adultos. Ambientes infantis negligentes e de abuso estão associados a narcisismo, destacando-se a invalidação emocional na compreensão das origens do narcisismo vulnerável.Introduction. One of the issues that remains current in the literature is related to the origin and the causes of narcissism. Research points to a link between the way that parenting is perceived and the vulnerable and grandiose narcissism. However, studying the parent’s emotional expression alone is not enough, it is necessary to understand the impact of emotional invalidation, which is specifically focused on a parent’s reaction to the young person’s inner experience. Objective. Study whether the parenting styles and the invalidation of a young person’s inner experiences are predictors of narcissism in young adults. Method. The study had 375 participants between the ages of 18 and 30, having parenting styles, emotional invalidation, vulnerable and grandiose narcissism as variables. Results. Emotional invalidation correlated with vulnerable narcissistic traits, directly and indirectly, observing a complete mediation between the mother's authoritarian style and the vulnerable narcissism. At the same time, it was observed that both parents had a partial mediation in the relationship between permissive style and vulnerable narcissism. The same was observed with the father's authoritarian style. On the other hand, style permissiveness predicts grandiose narcissism, but invalidation does not explain this relationship. Conclusion. Invalidation experiences and different parenting styles were associated with higher traits of pathological narcissism in young adults. Neglectful and abusive child environments are associated with narcissism, especially emotional invalidation concerning the origins of vulnerable narcissism

Investigation of rule control by controlling the effetcts of reinforcement history on human behavior

This study investigated the role of experimental history and of relative density of reinforcement on rule following behavior. Sixteen undergraduate students participated. Under a matching-to-sample procedure, with 3 comparison stimuli, the participants were asked to point the comparisons in sequence, according to their dimension, Color, Thickness or Form, in common to the sample. At the beginning of Phases 1, 2, 3 and 4, participants were exposed, respectively, to minimal instructions, a discrepant rule (specifying a non reinforced sequence), a corresponding rule (specifying a TFC sequence) and a repeated discrepant rule. Only the CTF sequence was reinforced in all phases. In Phase 3, two sequences, TFC and CTF, were concurrently reinforced (Concurrent FR 2 FR6 and FR2 FR6). Control by rules and by reinforcement history were both observed, under specific conditions. These findings have implications for drawing a distinction between behaviors controlled by rules and those shaped by contingencies.Este estudo investigou, com 16 universitários, o papel da história de reforço e da densidade relativa de reforço no seguimento de regra. Utilizou-se um procedimento de escolha segundo o modelo, com 3 estímulos de comparação; a tarefa consistia em apontar cada um dos 3 estímulos de comparação, em seqüência, de acordo com a dimensão (Cor, Espessura ou Forma) em comum com o modelo. As Fases 1, 2, 3 e 4 eram iniciadas, respectivamente, por instruções mínimas, regra discrepante (especificava a seqüência FCE), correspondente (especificava EFC) e discrepante. A seqüência CEF era a única reforçada em todas as fases. Na Fase 3, EFC era reforçada concorrentemente com CEF (concorrente FR2 FR6 e concorrente FR6 FR2). Nenhuma outra seqüência era reforçada. Observou-se tanto controle por regras quanto pela história de reforço, sob condições específicas. Os resultados têm implicações para a distinção entre o comportamento controlado por regras e o controlado por contingências

Autonomia e limites da jurisdição tributária

Dissertação de mestrado em Direito Tributário e FiscalDe um ponto de vista científico, a jurisdição tributária é um tema que, ainda nos dias de hoje, parece não motivar devida atenção e consideração. Nessa medida, é possível verificar-se, amiúde, falta de rigor quanto à sua definição, e ao seu âmbito de intervenção. Ademais, considerando as suas falhas, parece não existir uma séria intenção na sua correcção, sobretudo se tomarmos em consideração o facto de se verificarem constantes alterações às competências dos Tribunais Tributários, alterações essas que não se fundamentam numa linha de devida ponderação, não só do ponto de vista legal, como também do ponto de vista político. Esta política legislativa expõe uma tendente e prejudicial instrumentalização da justiça tributária, revelada em opções legislativas, as quais acabam por não verter, na prática, e na sua maioria, qualquer sentido de eficiência ou praticabilidade. Em nossa opinião, é essencial – senão urgente – introduzir, nesta temática, rigor e certeza jurídica, assim como é possível identificar vários e sérios problemas: ineficiente arrecadação de receitas tributárias; pendência decisória no quadro da justiça tributária e, sobretudo; a crise da tutela jurisdicional efectiva. A presente investigação, de pendor crítico, procurará compreender, numa perspectiva evolutiva, a natureza da jurisdição tributária, concretamente a sua autonomia e os seus limites. Em suma, e com o intuito de prestar a nossa contribuição a um exercício jurisdicional tributário cada vez mais eficiente, faremos uma análise ao seu percurso histórico, ao seu posicionamento – na dimensão constitucional e na dimensão infra-constitucional – e por fim, testaremos os limites das suas fronteiras.From a scientific point of view, tax jurisdicition is a subject that, even today, does not seem to motivate a great attention and significance. To that extend, it is possible to identify frequent imprecision and inaccuracies concerning its definition and scope of application. Moreover, considering its failures, it does not exist a serious intention of correction, mainly it we take into consideration that we are constantly verifying legal changes on Tax Court’s competences without a precise line of reasoning, not only from a legal but also from a political point of view. The legislative policy exposes a tending and harmful exploitation of the taxing justice, revealed in legislative options, which disclose, in practice, and mostly, any sense of efficiency or practicality. In our opinion, it is absolutely crucial to introduce rigor and legal certainty on these issues, as far as it is possible to identify several significant problems: the inefficient collection of tax revenues; the delay regarding Court’s decisions, and mostly; the crisis of the effective jurisdictional protection constitutionally prescribed. This research, critically inclined, seeks to understand, in an evolutionary perspective, the nature of taxing jurisdiction, specifically its autonomy and limits. In short, and in order to provide our contribution to a more efficient taxing jurisdictional exercise, we will make an analysis of its history course, and real positioning – in the constitutional and infra-constitucional dimensions – and finally, we will test the limits of its borders

Características de idosos acometidos pela doença de Alzheimer e seus familiares cuidadores principais

O objetivo deste trabalho foi caracterizar idosos acometidos pela doença de Alzheimer e seus familiares cuidadores principais. Trata-se de estudo descritivo, realizado no município de Maringá-PR, no período de dezembro de 2010 a março de 2011, desenvolvido com oitenta cuidadores. Os dados foram coletados por meio de entrevista e analisados por procedimentos estatísticos com análise por frequência simples e percentual absoluto. A maioria dos cuidadores era do sexo feminino, com idade média de 54,8 anos, casada, com 8 anos ou mais de estudo, e possuía algum problema de saúde. Dos idosos, a maioria era do sexo feminino, com idade média de 80,8 anos, tinha 3 anos ou menos de estudo, possuía comorbidades e estava no estágio moderado da doença. Conhecer o perfil dos cuidadores e doentes pode contribuir para adoção de estratégias de intervenção por parte dos profissionais de saúde que atendam as necessidades de forma individualizada e humanizada. Descritores: Doença de Alzheimer; Cuidadores; Idoso; Enfermagem

Uma análise do IFPB Campus Picuí e sua relevância socioeconômica para o Seridó Oriental paraibano

Sendo parte de minha dissertação este trabalho destina sua atenção a analisar a expansão e a interiorização dos Institutos Federais de Educação, Ciência e Tecnologia como a efetivação de uma política pública em educação, por meio da relação com o desenvolvimento local e regional. Objetivamos, portanto, analisar a implantação do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia da Paraíba (IFPB) no campus de Picuí-PB e seus impactos sociais e econômicos na microrregião do Seridó Oriental Paraibano, considerando a formação profissional dos jovens e a inserção dos egressos no mercado de trabalho regional no período de 2009 a 2020. Os procedimentos metodológicos e os instrumentos da referida pesquisa, bem como as etapas do levantamento bibliográfico e documental, da pesquisa de campo e da coleta de dados, como se deu a organização e a construção das análises com base nas categorias quantitativas e qualitativas. Com o aprofundamento dos estudos, percebemos que a interiorização dos Institutos Federais não trouxe apenas a qualificação profissional, o ingresso no mercado de trabalho ou o acesso às universidades, mas todo um conjunto de ações benéficas possibilitado pela aplicação de políticas públicas e que tem culminado com um ganho cultural e intelectual incomensurável, incapaz de ser quantificado nesta pesquisa, apenas. Compreendemos, portanto, que a implantação dos Institutos Federais possibilita um avanço qualitativo a partir de uma caminhada singular, um projeto de nação que entende a educação como compromisso de transformação e de ascensão do conhecimento, de objetivos capazes de transformar a vida social