Biochemical characterization of Ty1 retrotransposon protease

L

A retrovirális proteázok szerepének vizsgálata a retrovírusok életciklusának korai fázisában = Studies on the retroviral protease in the early phase of life-cycle

A kapsztid (CA) és nukleokapszid (NC) hasítási vizsgálatok elősegítésére számos retrovirális proteázt (PR) jellemeztük, többek között a human T-sejtes leukémia valamint a xenotróp egér leukemia vírus-rokon vírusét is. Igazoltuk a korábban azonosított HIV-1 CA hasítási helyeket, valamint egy új helyet is azonosítottunk. Számos egyszeres és többszörös mutációt hoztunk létre rekombináns, hexahisztidin farokkal expresszált CA fehérjében. A mutánsok proteolitikus érzékenysége jó egyezést mutatott a várt hatásokkal. Ugyanakkor még nyolc mutációval sem sikerült teljesen HIV-1 PR-rezisztenssé tenni a fehérjét. A vizsgált mutációkat bevittük egy harmadik generációs öninaktiválódó lentivírus rendszerbe is. Mind a proteáz érzékeny illetve hasítást gátló CA mutációkat tartalmazó vírusok fertőzőképessége csökkent. Meghatározott vagy jósolt NC fehérje hasítási helyeket tartalmazó oligopeptideket valamint rekombináns NC fehérjéket vizsgáltunk mint PR szubsztrátok. Eredményeink alapján nem csak lentivírus NC fehérjék lehetnek PR szubsztrátok. A virológiai vizsgálatok elősegítésére vizsgáltuk a HIV-1 PR specificitását NC alapú szubsztrátokkal, valamint számos „revertáns” szubsztrátok terveztünk, melyekben a cink-újj motívum belső része nem változott, a hasíthatóságot külső oldalláncok változtatása biztosította. Vizsgáltuk a celluláris protóm változását HIV-1 fertőzés során, és indukálódó fehérjéket azonosítottunk. | To facilitate the comparative capsid (CA) and nucleocapsid (NC) cleavage specificity studies, various retroviral proteases (PRs) were characterized including those of human T-cell lymthotropic and xenotropic murine leukemia virus-related viruses. We verified the previously found cleavage sites in CA of HIV-1 and identified a new one. Single and multiple cleavage site mutations were introduced into a recombinant his-tagged CA. The proteolytic susceptibility of the mutants was in good agreement with the expected changes. However, even eight mutations were not sufficient to make CA resistant towards HIV-1 PR. The studied mutations were introduced into a third generation self-inactivating HIV-1-based lentiviral system. Infectivity assays suggested, that both enhancing and proteolysis inhibitory mutations caused decrease in infectivity. We have studied oligopeptide substrates representing determined or predicted cleavage sites of retroviral nucleocapsid proteins, as well as recombinant NC forms. Cleavage data implied that cleavability of NC sequences might not be restricted to lentiviruses. To facilitate virological studies, we studied the HIV-1 PR specificity with NC-based substrates and designed “revertant” mutants in which cleavability was regained by introducing mutations into close vicinity of the zinc finger motifs. We have also studied the changes in the cellular proteome during the course of HIV-1 infection, and identified proteins with elevated expression

Interactions of retinoids with the ABC transporters P-glycoprotein and Breast Cancer Resistance Protein

K

Biochemical characterization of the xenotropic murine leukemia virus-related virus (XMRV)

Célul tűztük ki a xenotrópikus egér leukémia vírussal rokon vírus (XMRV) proteáz kinetikai vizsgálatát, az enzim stabilitásának és gátolhatóságának vizsgálatát HPLC valamint SDS-PAGE módszerek segítségével. Az enzim kinetikai paramétereit (KM, kcat, kcat/KM) szintetikus oligopeptid szubsztrát segítségével vizsgáltuk, az enzim dimerizációs képességét (Kdapp), valamint az enzim denaturációra hajlamát (UD50) 0-4 M urea tartalmú közegben. Vizsgáltuk a proteáz gátolhatóságát különböző proteáz inhibitorok (amprenavir, TL-3, acetil-pepsztatin és pepsztatin A) segítségével, magas ionerősségű közeg esetében HPLC módszert, míg alacsony sókoncentráció esetén SDS-PAGE módszert alkalmaztunk a gátlás nyomon követésére. Az SDS-PAGE módszer esetén szubsztrátként egy rekombináns egér leukémi vírus (MLV) Gag fragmentumot alkalmaztunk. Összehasonlítottuk az enzim stabilitási értékeit a 1-es típusú humán immundeficiencia vírus (HIV-1) proteáz értékeivel. Molekuláris modellezéssel hasonlítottuk össze a HIV-1 és XMRV proteázoknak az acetil-pepsztatin és pepsztain A inhibitorokkal alkotott komplexeit, a számított kölcsönhatási energiák segítségével vizsgáltuk az inhibitorok lehetséges kötőmódjait. Kollaborációs partnereink az enzim-inhibitor komplexeket (amprenavir, TL-3, acetil-pepsztatin és pepsztatin A) röntgenkrisztallográfiás elemzésnek vetették alá, ezzel magyarázatot adva a gátlás lehetséges módjára. Az XMRV proteáz jóval érzékenyebbnek bizonyult az urea koncentrációra, mint a HIV-1 proteáz. A Ki értékek alapján a tesztelt inhibitorok közül az amprenavir bizonyult a leghatékonyabb, míg a pepsztatin A a legkevésbé hatékony inhibitornak. A korábbi és jelenlegi molekuláris modellezésen alapuló vizsgálatok alapján megállapítottuk, hogy az S4/S4’ kölcsönhatás is lényegesen hozzájárul az acetil-pepsztatin és pepsztatin inhibitoroknak a HIV-1 és az XMRV proteázokhoz történő kötődéséhez. Az XMRV proteáz-pepsztatin A két inhibitoros kötőmódja energetikailag kedvezőbb, míg az acetil-pepsztatin esetében az egyszeres és kettős kötődési mód hasonló kölcsönhatási energiákat adott. Az S3/S3’ kötőhely mérete XMRV esetén kisebb, mint a HIV-1 esetén, így a Sta6-S3’ kölcsönhatás sokkal kedvezőbb a HIV-1 PR esetében, mint az XMRV PR-nál, ezért a HIV-1 az egyszeres kötési módot részesíti előnyben. A röntgenkrissztallográfiai adatok alapján, megállapítottuk, hogy az acetil-pepsztatin a többi inhibitorhoz képest eltérő módon kötődik az enzimhez, mivel két inhibitor molekula kötődik az XMRV PR dimerjéhez, míg a TL-3 és az amprenavir egyetlen molekulával kötődik, mégis az inhibitorok és az enzim közötti kölcsönhatások rendkívül hasonlóak. Our objective was the kinetic examination of the viral protease related to the xenotropic murine leukemia virus (XMRV) and the examination of the stability and inhibition of the enzyme with the help of the HPLC as well as the SDS-PAGE methods. We examined the kinetic parameters of the enzyme (Km, kcat, kcat/Km) with the help of a synthetic oligopeptide substrate while the stability of the enzyme, i.e. its ability to dimerize (Kdapp) and the tendency of the enzyme towards dissociation (UD50) - in a buffer containing an incrementing urea concentration by applying a chromogenic substrate. We examined the inhibition of the protease with the help of various protease inhibitors (amprenavir, TL-3, acetyl-pepstatin and pepstatin A), while applying the HPLC method in a high salt concentration buffer, and the SDS-PAGE method in the case of a low salt concentration to follow up the inhibition measurements. In the case of the SDS-PAGE method we applied an MLV Gag fragment as a substrate. We compared the stability values of the enzyme with the values of the HIV-1 protease. We modeled the enzyme-inhibitor complex formed in this way (in the case of acetyl-pepstatin and pepstatin A) and we examined the interaction energies and the potential binding of the inhibitors. The XMRV protease proved to be much more sensitive to the concentration of urea than the HIV-1 protease. Among the inhibitors tested on the basis of Ki values amprenavir proved to be the most efficient inhibitor while pepstatin A – the least efficient inhibitor. On the basis of molecular modeling we established that the S4/S4’ interaction also substantially contributes to the binding of the acetyl-pepstatin and pepstatin inhibitors to the HIV-1 and XMRV proteases. The two-inhibitor binding method of the XMRV protease-pepstatin A is more favorable from an energetic point of view, while in the case of acetyl-pepstatin, the interaction of the dual binding method provided similar interaction energies. The Sta6-S3’ interaction is much more favorable in the case of the HIV-1 PR than in the case of the XMRV PR, thus HIV-1 prefers the single binding method. X-ray crystallographic data were disclosed to us by our collaboration partner, on the basis of which we established that pepstatin A binds to the enzyme in a different manner as compared to other inhibitors, as two inhibitor molecules are bound to the PR dimer of XMRV while TL-3 or amprenavir with a single molecule, yet the interactions between the inhibitors and the enzyme are remarkably similar.d

Different Mutation Tolerance of Lentiviral (HIV-1) and Deltaretroviral (BLV and HTLV) Protease Precursors

The bovine leukemia virus (BLV) and the human T-lymphothropic viruses (HTLVs) are members of the deltaretrovirus genus of Retroviridae family. An essential event of the retroviral life cycle is the processing of the polyproteins by the viral protease (PR); consequently, these enzymes became important therapeutic targets of the anti-retroviral drugs. As compared to human immunodeficiency viruses (HIVs), the deltaretroviruses have a different replication strategy, as they replicate predominantly in the DNA form, by forcing the infected cell to divide, unlike HIV-1, which replicates mainly by producing a vast number of progeny virions and by reinfection. Due to bypassing the error-prone reverse transcription step of replication, the PRs of deltaretroviruses did not undergo such extensive evolution as HIV PRs and remained more highly conserved. In this work, we studied the abilities of wild-type and modified BLV, HTLV (type 1, 2 and 3), and HIV-1 PRs (fused to an N-terminal MBP tag) for self-processing. We designed a cleavage site mutant MBP-fused BLV PR precursor as well, this recombinant enzyme was unable for self-proteolysis, the MBP fusion tag decreased its catalytic efficiency but showed an unusually low Ki for the IB-268 protease inhibitor. Our results show that the HTLV and BLV deltaretrovirus PRs exhibit lower mutation tolerance as compared to HIV-1 PR, and are less likely to retain their activity upon point mutations at various positions, indicating a higher flexibility of HIV-1 PR in tolerating mutations under selective pressure

A modular system to evaluate the efficacy of protease inhibitors against HIV-2.

The human immunodeficiency virus (HIV) protease is a homodimeric aspartyl protease that is crucial for the viral life-cycle, cleaving proviral polyproteins, hence creating mature protein components that are required for the formation of an infectious virus. With diagnostic measures and clinically used protease inhibitors focusing on HIV-1, due to its higher virulence and prevalence, studies of the efficacy of those inhibitors on HIV-2 protease remain widely lacking. Utilizing a wild-type HIV-2 vector backbone and cloning techniques we have developed a cassette system where the efficacy of clinically used protease inhibitors can be studied for various serotypes of HIV-2 protease both in enzymatic and cell culture assays. In our experiments, optimization of the expression protocol led to a relatively stable enzyme, for cell culture assays, the efficiency of transfection and transduction capability of the modified vector was tested and was not found to differ from that of the wild-type, moreover, a 2nd generation protease inhibitor was used to demonstrate the usefulness of the system. The combination of assays performed with our cassette system is expected to provide an accurate measure of the efficacy of currently used; as well as experimental protease inhibitors on HIV-2

Biochemical Characterization, Specificity and Inhibition Studies of HTLV-1, HTLV-2, and HTLV-3 Proteases

The human T-lymphotropic viruses (HTLVs) are causative agents of severe diseases including adult T-cell leukemia. Similar to human immunodeficiency viruses (HIVs), the viral protease (PR) plays a crucial role in the viral life-cycle via the processing of the viral polyproteins. Thus, it is a potential target of anti-retroviral therapies. In this study, we performed in vitro comparative analysis of human T-cell leukemia virus type 1, 2, and 3 (HTLV-1, -2, and -3) proteases. Amino acid preferences of S4 to S1′ subsites were studied by using a series of synthetic oligopeptide substrates representing the natural and modified cleavage site sequences of the proteases. Biochemical characteristics of the different PRs were also determined, including catalytic efficiencies and dependence of activity on pH, temperature, and ionic strength. We investigated the effects of different HIV-1 PR inhibitors (atazanavir, darunavir, DMP-323, indinavir, ritonavir, and saquinavir) on enzyme activities, and inhibitory potentials of IB-268 and IB-269 inhibitors that were previously designed against HTLV-1 PR. Comparative biochemical analysis of HTLV-1, -2, and -3 PRs may help understand the characteristic similarities and differences between these enzymes in order to estimate the potential of the appearance of drug-resistance against specific HTLV-1 PR inhibitors