"Untersuchungen zur biologischen Funktion des trankriptionellen Repressors E2F6"

E2F Transkriptionsfaktoren sind zentrale Regulatoren der Zellproliferation und der Zelldifferenzierung. E2F Proteine binden über eine konservierte DNA Bindedomäne an DNA Motiv der Sequenz (T(c/g)CCGC(c/g). Dieses Konsensusmotiv konnte in den Promotoren zahlreicher Gene nachgewiesen werden. Der E2F Familie werden derzeit sieben Proteine zugeordnet (E2F1-E2F7). E2F1-E2F5 sind transkriptionelle Aktivatoren. Ihre transaktivierende Wirkung wird durch die zellzyklusabhängige Bindung an Pocket Proteine (pRb, p107, p130) negativ reguliert. E2F1-E2F5 zeigen eine sowohl spezifische als auch überlappende Funktionen in der Zellzyklusregulation und in der Embryonalentwicklung. Dagegen bilden E2F6 und E2F7 transkriptionelle Repressoren, die nicht an Pocket Proteine binden. Ihre physiologische Funktionen sind unklar. Im Rahmen dieser Arbeit sollte die in-vivo Funktion von E2F6 analysiert werden. Hierzu wurden E2F6 defiziente Mäuse charakterisiert, die in Vorarbeiten durch Dr. Stefan Gaubatz hergestellt und zur Verfügung gestellt wurden. E2F6 defiziente Mäuse sind lebensfähig, gesund und fruchtbar. E2f6-/- Fibroblasten proliferieren normal und zeigen eine zu den Kontrollzellen identische Zellzyklusverteilung. E2F6 defiziente Fibroblasten arretieren reversibel in der G0 Phase des Zellzyklus. Außerdem induzieren sie eine normale replikative und onkogene Seneszenz. Aus diesen Beobachtungen kann geschlossen werden, dass E2F6 nicht für die Zellzyklusregulation benötigt wird. Im Rahmen dieser Arbeit konnten zwei gewebespezifische Phänotypen E2F6 defizienter Mäuse beobachtet werden: Zum einen wurde ein Defekt in der Spermatogenese E2F6 defizienter Männchen festgestellt, dessen molekulare Ursache jedoch unklar ist. Dieser Defekt beeinträchtigt nicht die Fruchtbarkeit von E2f6-/- Mäusen. Zum anderen konnten posteriore homeotische Transformationen entlang der antero-posterioren Achse von Skeletten E2F6 defizienter Mäuse identifiziert werden. Diese ähneln auffällig den Skelettphänotypen Polycomb Protein defizienter Mäuse. Da vorangegangene Studien eine Interaktion von E2F6 mit Polycomb Proteinen zeigten, konnte durch den in dieser Arbeit beobachteten E2f6-/- Phänotyp erstmals in-vivo Evidenz für einen funktionelle Interaktion von E2F6 mit Polycomb Proteinen erhalten werden. Polycomb Proteine inhibieren die Expression von Hox Genen. Es kann daher spekuliert werden, dass E2F6 Polycomb Proteine an die Promotoren von Hox Gene rekrutiert. Im Gegensatz zu den Polycomb defizienten Mäusen konnte allerdings in ersten Untersuchungen keine deregulierte Expression spezifischer Hox Gene in 9.5 Tage alten E2f6-/- Embryonen nachgewiesen werden. Unter Verwendung eines cDNA Microarrays konnten die meiotischen Kohäsine Smc1l2 (Structural Maintenance of Chromosomes 1l2) und Stag3 (Stromal Antigen 3), sowie das noch nicht charakterisierte Gen XM_196054 als E2F6 regulierte Gene identifiziert und mit verschiedenen experimentellen Ansätzen bestätigt werden. Durch den Nachweis von E2F6 auf dem endogenen Promotor von Stag3 kann eine direkte Regulation von Stag3 durch E2F6 angenommen werden. Weiterhin konnte eine E2F Konsensussequenz im Stag3 und Smc1l2 Promotor identifiziert werden, die eine Bindung von E2F6 ermöglicht und für eine Repression benötigt wird. Anhand dieser Gene wurde in dieser Arbeit der E2F6 vermittelte Repressionsmechanismus untersucht: Dabei konnte beobachtet werden, dass Histon H3 des Smc1l2 und Stag3 Promotors in E2f6+/+, nicht jedoch in E2f6-/- Fibroblasten an H3 Lysin 9 (K9) dimethyliert und am Lysin 27 (K27) trimethyliert ist. Diese Methylierungen korrelieren mit der Repression der Stag3 und Smc1l2 Expression in E2f6+/+ Fibroblasten. Zusätzlich konnte in E2F6-/- Fibroblasten eine stärkere Acetylierung von Histon H3 am Stag3 Promotor im Vergleich zu E2f6+/+ Fibroblasten gezeigt werden. Diese Histonacetylierung korreliert mit einer Expression von Stag3 in E2F6 defizienten Zellen. In Einklang damit steht die Beobachtung, dass die stabile Repression von Smc1l2 und Stag3 die Aktivität von Histondeacetylasen benötigt. Außerdem wurde Evidenz für eine Funktion von DNA Methylierungen in der stabilen Smc1l2 und Stag3 Inhibition gewonnen. Somit kann folgendes Modell vorgeschlagen werden: Durch die Bindung von E2F6 werden Histondeacetylasen und/oder Histonmethyltransferasen an die Promotoren meiotischer Kohäsine rekrutiert. Der Nachweis des Polycomb Proteins RYBP auf dem Stag3 Promotor von E2f6+/+ Fibroblasten zeigt, dass eine dauerhafte, stabile und vererbbare Inhibition der Kohäsinexpression möglicherweise durch Polycomb Proteine vermittelt werden könnte. Im Rahmen dieser Arbeit konnte eine Funktion von E2F6 in der Inhibition zell- und differenzierungsspezifischer Gene identifiziert werden. Gleichzeitig wurde Evidenz für einen aktiven E2F6 Repressionsmechanismus erhalten, der durch Histonmodifikationen die Bindung von Polycomb Proteinen an E2F6 regulierte Promotoren ermöglicht

Pluripotency without Max

Myc/Max complexes are thought to be essential for maintaining pluripotency and self-renewal of embryonic stem cells (ESCs). In this issue of Cell Stem Cell, Hishida et al. (2011) provide genetic evidence that this requirement can be bypassed in well-defined culture conditions

Das tumortherapeutische Potential optimierter Agonisten der Rezeptoren des Apoptose-induzierenden Liganden TRAIL

Trotz der Entwicklung neuer Wirkstoffen und verbesserter Therapien ist die Bekämpfung von Tumoren weiterhin eine große Herausforderung. Apo-2L oder „tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis ligand“ (TRAIL), TRAIL, ist ein Mitglied der TNF-Familie und ein vielversprechendes Protein für die Krebstherapie, weil es selektiv in transformierten, nicht aber in gesunden Zellen Apoptose induziert. Zudem scheint das TRAIL-System die Resistenz von vielen Tumoren gegenüber derzeitigen Behandlungs-Strategien, die im wesentlichen aus Chemotherapie und Bestrahlung bestehen, überwinden zu können. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden zuerst rekombinante multimerisierte Einzelkettenantikörperfragmente mit den Spezifitäten anti-TRAIL-R2 und anti-CD95 (APO-1/Fas) hergestellt und charakterisiert. Aus Hybridomzellen, die monoklonale Antikörper gegen TRAIL-R2 und CD95 produzieren, wurden nach RNA-Isolierung und cDNA-Synthese die für die variablen schweren und leichten Antikörperketten (VH und VL) kodierenden Gene mittels PCR amplifiziert. Die Herstellung der Expressionsvektoren erfolgte durch C-terminale Fusion der VH- und VL-Expressionskassetten an die Multimerisierungsdomäne eines modifizierten Leuzin-Zippers. Nach Transformation von E.coli mit den Expressionsvektoren und Expression der rekombinanten Proteine wurde die Spezifität und Aktivität der scFv-anti-TRAIL-R2- und scFv-anti-APO-1-Fragmente nach erfolgreicher in vitro Rückfaltung untersucht. Funktionelle Bindung von scFv-anti-TRAIL-R2-Antikörperfragmenten konnte auf TRAIL-R2-exprimierenden Tumorzellen durch FACS-Analyse nachgewiesen werden. Die lytische Aktivität des Antikörperderivates auf verschiedenen Tumorzellen war nur minimal. Im Falle des scFv-anti-APO-1-Antikörperfragmentes konnte sowohl Bindung, als auch zytotoxische Aktivität auf CD95-exprimierenden Tumorzellen gezeigt werden. Das agonistische Potential war jedoch nicht höher als beim Ausgangsantikörper anti-APO-1. Zudem wurde in dieser Arbeit eine hochaktive rekombinante Form von TRAIL, IZ-TRAIL, entwickelt. Rekombinant in E.coli exprimiertes IZ-TRAIL konnte in großen Mengen durch sequentielle Affintitätschromatographie gereinigt werden. Hohe anti-tumorale Wirksamkeit von IZ-TRAIL als Einzeltherpeutikum sowie in Kombination mit Chemotherapeutika wurde auf zahlreichen Tumorzellen in vitro gezeigt. Trotz der hohen Wirksamkeit auf Tumorzellen, konnte keine Zytotoxizität in der Maus und auf frisch isolierten primären humanen Hepatozyten, auch in Kombination mit diversen Chemotherapeutika nachgewiesen werden. Mit IZ-TRAIL wurde eine TRAIL-Version entwickelt, die im Vergleich zu nicht getaggten TRAIL-Versionen eine hohe anti-tumorale Wirkung hat, und gleichzeitig für primäre Zellen nicht toxisch ist

Regulation der Genexpression von MYCN in humanen Neuoblastomzellen durch Transkriptionsfaktoren der E2F-Familie

Seit fast 30 Jahren ist bekannt, dass die Amplifikation und Expression des Onkogens MYCN in Neuroblastomen mit einer sehr ungünstigen Prognose für die Patienten einhergeht. Dennoch liegen die Mechanismen der Genregulation von MYCN weiterhin größtenteils im Dunkeln. Die Präsenz potentieller Bindungsstellen für E2F-Proteine im Promotor des MYCN-Gens sowie Zellkulturexperimente lieferten Hinweise auf eine Rolle der Transkriptionsfaktoren der E2F-Familie in der Regulation der N-myc-Expression. Ziel dieser Arbeit war die Beantwortung der Frage, ob E2F-Proteine notwendig sind, um eine primär hohe Expression von N-myc in Neuroblastomzellen mit Amplifikation des Onkogens aufrechtzuerhalten, und ob sie hinreichend sind, um die Transkription von MYCN in Zellen ohne endogene Expression von N-myc einzuleiten. Durch Überexpression des Tumorsuppressorproteins p16, welches zu einer Inaktivierung endogener E2F-Proteine führt, konnte die MYCN-mRNA-Menge in Neuroblastomzellen deutlich gesenkt werden. Vergleichbare Resultate wurden durch Expression von dominant negativem E2F-1 erzielt. Da in einigen Studien gezeigt werden konnte, dass Myc-Proteine ihrerseits E2F-Gene aktivieren können, nehmen wir an, in aggressiven Neuroblastomen könnte eine positive Rückkopplungsschleife zwischen E2F-Transkriptionsfaktoren auf der einen und N-myc auf der anderen Seite existieren, die die gesteigerte Aktivität des MYCN-Onkogens aufrechterhält. Stabil transfizierte E2F-ER-Fusionsproteine waren jedoch nicht in der Lage, das endogene MYCN-Gen in Neuroblastomzellen ohne Expression von N-myc anzuschalten. E2F-Proteine werden folglich für das volle Ausmaß der starken Expression von N-myc in Neuroblastomen benötigt, sind aber nicht ausreichend, um das Onkogen MYCN in Zellen ohne endogenes N-myc zu aktivieren. In der Zukunft könnte durch Verhinderung der Bindung von E2F-Proteinen an den MYCN-Promotor oder durch gentherapeutische Ansätze, die z.B. mittels viraler Infektion den Signalweg zwischen p16 und E2F rekonstruieren, die Expression von N-myc in Neuroblastomen gesenkt werden, so dass die Aggressivität der Tumore reduziert und die individuelle Prognose der Patienten verbessert werden könnte

Transduktion und Zellzyklusregulation durch das rekombinante Tat-p27(KIP1)-Fusionsprotein in Neuroblastomzellen

Das Neuroblastom ist eine der häufigsten Tumorerkrankung im Kindesalter. Das Tumorsuppressorprotein, p27(KIP1), ist ein prognostischer Faktor bei Neuroblastomerkrankungen und korreliert positiv mit einer guten Prognose der Erkrankung. Das Tat-Fusionsprotein ist ein erst kürzlich beschriebenes Konstrukt für die Proteintransduktion und stellt eine Alternative zur konventionellen Gentherapie dar. In der vorliegenden Arbeit wurde das Tat-p27(KIP1)-Fusionsprotein hergestellt und dieses in die Neuroblastomzellen substituiert und die darausfolgende Konsequenz bezüglich des Zellzyklus untersucht, um so die prognosebestimmende Wirkung des p27(KIP1)-Proteins bei Neuroblastomen besser verstehen zu können

Modeling of innovative energy technologies utilization of polymers

Розглянуто деякі особливості використання ТПВ на комплексному підприємстві, яке може забезпечувати всі свої енергетичні потреби самостійно. Дослідження спрямовані на вивчення таких питань, як розробка моделей утилізації-модифікації полімерної частини ТПВ або тари та пакування. При цьому враховувалися фактори вибору науково-обґрунтованих методів переробки та утилізації полімерів; розробку необхідних технологічних схем і устаткування для переробки полімерних відходів; вибір підприємств для реалізації утилізації полімерів і виду енергетичних ресурсів для реалізації цих проектних рішень.Some features of the possibilities of solving evidence-based problems of improving the use of wastes of different industries on a complex enterprise that can provide all its energy needs alone. The problem of wastes utilization and recycling is present as complex research and analysis of energy- and resource saving processes for treatment of polymer wastes of various origin. The research focused on the study of issues such as the development of models of waste-modifying polymer. The investigation are focused in researching such problems as selection of scientific based methods of wastes to be utilized or recycled; the development of appropriated process flow sheets and choice of modifications additives and equipment for polymers waste recycling. The choice of appropriate plants with selected energy resources is very important for projects realization

Drosophila HUWE1 Ubiquitin Ligase Regulates Endoreplication and Antagonizes JNK Signaling During Salivary Gland Development

The HECT-type ubiquitin ligase HECT, UBA and WWE Domain Containing 1, (HUWE1) regulates key cancer-related pathways, including the Myc oncogene. It affects cell proliferation, stress and immune signaling, mitochondria homeostasis, and cell death. HUWE1 is evolutionarily conserved from Caenorhabditis elegance to Drosophila melanogaster and Humans. Here, we report that the Drosophila ortholog, dHUWE1 (CG8184), is an essential gene whose loss results in embryonic lethality and whose tissue-specific disruption establishes its regulatory role in larval salivary gland development. dHUWE1 is essential for endoreplication of salivary gland cells and its knockdown results in the inability of these cells to replicate DNA. Remarkably, dHUWE1 is a survival factor that prevents premature activation of JNK signaling, thus preventing the disintegration of the salivary gland, which occurs physiologically during pupal stages. This function of dHUWE1 is general, as its inhibitory effect is observed also during eye development and at the organismal level. Epistatic studies revealed that the loss of dHUWE1 is compensated by dMyc proeitn expression or the loss of dmP53. dHUWE1 is therefore a conserved survival factor that regulates organ formation during Drosophila development.Peer reviewe

Gene expression profiles of gliomas in formalin-fixed paraffin-embedded material

BACKGROUND: We have recently demonstrated that expression profiling is a more accurate and objective method to classify gliomas than histology. Similar to most expression profiling studies, our experiments were performed using fresh frozen (FF) glioma samples whereas most archival samples are fixed in formalin and embedded in paraffin (FFPE). Identification of the same, expression-based intrinsic subtypes in FFPE-stored samples would enable validation of the prognostic value of these subtypes on these archival samples. In this study, we have therefore determined whether the intrinsic subtypes identified using FF material can be reproduced in FFPE-stored samples. METHODS: We have performed expression profiling on 55 paired FF-FFPE glioma samples using HU133 plus 2.0 arrays (FF) and Exon 1.0 ST arrays (FFPE). The median time in paraffin of the FFPE samples was 14.1 years (range 6.6-26.4 years). RESULTS: In general, the correlation between FF and FFPE expression in a single sample was poor. We then selected the most variable probe sets per gene (n = 17 583), and of these, the 5000 most variable probe sets on FFPE expression profiles. This unsupervised selection resulted in a better concordance (R-2 = 0.54) between expression of FF and FFPE samples. Importantly, this probe set selection resulted in a correct assignment of 87% of FFPE samples into one of seven intrinsic subtypes identified using FF samples. Assignment to the same molecular cluster as the paired FF tissue was not correlated to time in paraffin. CONCLUSION: We are the first to examine a large cohort of paired FF and FFPE samples. We show that expression data from FFPE material can be used to assign samples to intrinsic molecular subtypes identified using FF material. This assignment allows the use of archival material, including material derived from large-randomised clinical trials, to determine the predictive and/or prognostic value of 'intrinsic glioma subtypes' on Exon arrays. This would enable clinicians to provide patients with an objective and accurate diagnosis and prognosis, and a personalised treatment strategy. British Journal of Cancer (2012) 106, 538-545. doi: 10.1038/bjc.2011.547 www.bjcancer.com Published online 20 December 2011 (C) 2012 Cancer Research U

Investigating Initial Driver Intention on Overtaking on Rural Roads

Driver intention recognition is essential to the development of advanced driver assistance systems providing real-time support. Current approaches for the recognition of overtaking intentions focus on drivers’ observable behaviors, neglecting the fact that the intention to overtake a slower lead car emerges earlier than the resulting behavior. This paper aims to distinguish the "intention emerging process", when drivers form the initial intention to overtake, from the "action executing process", when drivers execute the overtaking maneuver. A driving simulator study has been conducted to investigate the influence of the lead vehicle type and lead vehicle speed on initiating driver’ intention on overtaking on rural roads, and the effect of the complexity of the oncoming traffic on executing overtaking. The results show that the initial driver intention to overtake appears much earlier than the execution of the overtaking maneuver. The lead vehicle speed has a significant influence on initial driver intention in the "intention emerging process", while time to overtake increases with the number of the oncoming vehicles in the "action execution process". These results can contribute to the development of models for driver intention recognition by extending the prediction horizon from the recognition to a prediction of driving maneuvers. Document type: Conference objec