The influence of free fatty acids on the development of liver inflammation

Das Hepatozellulare Karzinom ist die häufigste Form des Leberkrebses und die dritthäufigste Krebstodesursache. Es entsteht in Folge einer chronischen Leberentzündung, deren Ursache häufig eine Fettleber ist. Fettleibigkeit und die entstehende Fettleber sind prädestinierende Vorrausetzungen für die Entwicklung einer Fettleberentzündung. Da Entzündungen eine große Rolle bei der Entstehung und Entwicklung von Leberkrebs spielen, haben wir versucht, die Rolle der freien Fettsäuren, deren Konzentration bei Fettlebererkrankungen erhöht ist, aufzuklären. Dafür haben wir in-vitro Experimente mit primären Leberzellenzellen der Ratte durchgeführt, in denen die Zellen mit freien Fettsäuren behandelt und anschließend die Proteinphosphorylierung, die Genexpression und die Sekretion eines pro-inflammatorischen Zytokins analysiert wurde. Da die „Sheddase“ ADAM17/TACE in der Konvertierung von Vorstufen von entzündungsbeteiligten Faktoren in ihre lösliche, aktive Form beteiligt zu sein scheint, waren wir an einer möglichen Veränderung der Enzymaktivität durch freie Fettsäuren auf lebenden Zellen interessiert. Um die in-vivo Veränderungen, die durch eine fettreiche Nahrung entstehen, abschätzen zu können, wurde Ratten Öl mittels Schlundsonde verabreicht und die Fettsäuren im Plasma und die Genexpression in der Leber analysiert. Die Behandlung von Rattenzellen mit einer gesättigten Fettsäure, führte zu einem zweifachen Anstieg der TNFα mRNA in Kupfferzellen, was durch Inhibierung von einem Fettsäurerezeptor vermindert werden konnte. Die Ölschlundierung von Ratten führte zu einer Erhöhung der freien Fettsäuren im Serum der Tiere und zu der Expression von Genen, die auf eine erhöhte Forderung der Leber durch fettreiche Nahrung schließen lassen. Die meisten Veränderungen wurden in mesenchymalen Zellen beobachtet, was auf deren wesentliche Rolle in Immunreaktionen hindeuten könnte

Fab antibody fragment-functionalized liposomes for specific targeting of antigen-positive cells

Liposomes functionalized with monoclonal antibodies or their antigen-binding fragments have attracted much attention as specific drug delivery devices for treatment of various diseases including cancer. The conjugation of antibodies to liposomes is usually achieved by covalent coupling using cross-linkers in a reaction that might adversely affect the characteristics of the final product. Here we present an alternative strategy for liposome functionalization: we created a recombinant Fab antibody fragment genetically fused on its C-terminus to the hydrophobic peptide derived from pulmonary surfactant protein D, which became inserted into the liposomal bilayer during liposomal preparation and anchored the Fab onto the liposome surface. The Fab-conjugated liposomes specifically recognized antigen-positive cells and efficiently delivered their cargo, the Alexa Fluor 647 dye, into target cells in vitro and in vivo. In conclusion, our approach offers the potential for straightforward development of nanomedicines functionalized with an antibody of choice without the need of harmful cross-linkers.This work has received funding from the European Union's Seventh Framework Program (FP7/2007-2013; grant agreement NMP4-LA-2009-228827 NANOFOL) and Horizon 2020 Research and Innovation Program (grant agreement No 683356 - FOLSMART), further from the Portuguese Foundation for Science and Technology under the scope of the strategic funding of UID/BIO/04469/2013 unit and COMPETE 2020 (POCI-01-0145-FEDER-006684) and BioTecNorte operation (NORTE-01-0145-FEDER-000004) funded by the European Regional Development Fund under the scope of Norte2020.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

The myeloid PI3K/PTEN signaling axis in colitis and colitis associated colon cancer

Der PI3K/PTEN Signalweg reguliert die Bildung und Funktion von Zellen des angeborenen Immunsystems. Das genetische Entfernen von PTEN führt zur Überaktivität des PI3K Signalwegs und seiner weiterführenden Komponenten. Das führt zur Repolarisierung von myeloiden Zellen und resultiert in abgeschwächten Entzündungsreaktionen. In akuten Entzündungs- und Infektionsmodellen zeigen Mäuse mit myeloider PTEN Defizienz eine verminderte Produktion von entzündungsfördernden und eine erhöhte Produktion von entzündungshemmenden Faktoren. Im einem Lungenfibrosemodell führt die myeloide PTEN Defizienz dazu, dass Fibrose und Entzündungsreaktionen verstärkt auftreten. Weiters sind T-Zell Reaktionen in Autoimmunmodellen abgeschwächt und myeloide PTEN-KO Mäuse zeigen verminderte Anzeichen von Erkrankung. Unsere Hypothese war daher, dass die abgeschwächte Immunantwort in PTENfl/fl LysM cre Mäuse dazu führt, dass die Kontrolle der Tumorentstehung durch das Immunsystem gestört ist und es zu einer erhöhten Tumorinzidenz kommt. Wir sind an diese Fragestellung mit zwei unterschiedlichen Tumormodellen herangegangen: dem Kolitis-assoziierten Kolon Tumormodell und dem implantierten B16-Melanommodell. Im ersten Model zeigten die myeloiden PTEN-KO Mäuse eine erhöhte Tumorinzidenz sowie eine höhere Tumorwachstums- und Mortalitätsrate. Zusätzlich war die Anzahl an CD8[alpha]+ dendritischen Zellen in der Milz, die die Fähigkeit zur Kreuzpräsentation haben, erhöht. Die Analyse des Transkriptionsprogramms in diesen Zellen hat gezeigt, dass die Faktoren, die für die Entwicklung von CD8[alpha]+ dendritischen Zellen notwendig sind, in myeloiden PTEN-defizienten Mäuse besonders ausgeprägt sind. Diese antigenpräsentierenden Zellen exprimierten zusätzlich die Immuncheckpoint blockierenden Oberflächenmoleküle PD-L1 und PD-L2 und verhinderten dadurch die Aktivierung von CD8+ T-Zellen. Im B16-Melanommodell zeigten die myeloiden PTEN-KO Mäuse ebenso ein verstärktes Tumorwachstum. Die T-Zellen dieser Mäuse lysierten Tumorzellen weniger effizient als T-Zellen von Wildtyp Mäusen. Zusätzlichen zeigten CD4+ T-Zellen Anzeichen eines regulatorischen Phänotyps. Wir haben diese Fragestellung in Mäusen weitergeführt, die die PTEN-Defizienz spezifisch in dendritischen Zellen haben und verwendeten dafür die PTENfl/fl CD11c cre Maus. Allerdings zeigten diese Mäuse einen viel stärker ausgeprägten Phänotyp im Kolontumormodell im Bezug auf die Mortalitätsrate. In diesem Modell begannen die Mäuse schon während der Entzündungsphase zu sterben. In akuten und chronischen Kolitismodellen haben wir eine ähnliche Mortalitätsrate in myeloiden PTEN-KO Mäusen beobachtet, obwohl bei diesen Versuchen alle Wildtyp Mäuse überlebt haben. In den sekundären lymphoiden Organen der PTEN-KO Mäusen war die Anzahl an T-Lymphozyten vermindert, wohingegen die Anzahl an dendritischen Zellen erhöht war. Diese exprimierten zugleich sowohl stimulatorische als auch inhibitorische Oberflächenmoleküle. Andererseits zeigten ex vivo stimulierte T-Zellen von PTEN-KO Mäusen eine höhere Fähigkeit zur Produktion von IFN[gamma]. Zusätzlich hatten diese Mäuse eine höhere Belastung mit Baktieren, speziell die Milz war betroffen, wohingegen in Wildtyp Mäusen gar keine Bakterien in den Milzen nachgewiesen werden konnten. Im Gesamten deutet das auf eine nicht effizient iniziierte oder sogar aktiv unterdrückte T-Zell Antwort hin. Der PI3K/PTEN Signalweg reguliert die Entwicklung und Polarisierung von myeloiden Zellen. Bei Infektionen und Entzündungen zeigen Mäuse mit myeloider PTEN Defizienz abgeschwächte Entzündungsreaktionen, was in der Kontrolle der Tumorentstehung durch das Immunsystem ein Nachteil ist und in ungehindertem Tumorwachstum resultiert. Unsere Daten deuten darauf hin, dass eine Blockade des PI3K Signalwegs zusätzliche, positive Effekte in der Krebsbehandlung haben kann, in dem sie das angeborene Immunsystem aktiviert.The PI3K/PTEN signaling pathway regulates development and function of innate cells. Genetic deletion of PTEN leads to hyper-activation of the PI3K pathway and its downstream signaling via Akt and mTOR resulting in the polarization of myeloid cells towards a less inflammatory phenotype. In models of acute infection and inflammation, myeloid PTEN-deficient mice (PTENfl/fl LysM) respond with less production of inflammatory and increased production of anti-inflammatory factors. In contrast, in a model of bleomycin induced lung fibrosis, conditional PTEN-KO mice exhibit enhanced fibrosis and inflammation. In models for autoimmunity, T-cell responses are attenuated and myeloid PTEN-deficient mice show protection from these diseases. We hypothesized that the observed anti-inflammatory phenotype in PTENfl/fl LysM cre mice would reduce tumor immune surveillance, since an active immune system is indispensable for prohibiting tumor development. We addressed this issue using an endogenously grown and an implanted tumor model, the colitis associated colon cancer and the B16-melanoma model. Applying the former model, we observed an increase in tumor burden and mortality in myeloid PTEN-deficient mice. In addition, these animals exhibited elevated numbers of CD8[alpha]+ dendritic cells in their spleens that are capable of cross-presenting antigen. This finding was further substantiated by the observation that activation of the transcriptional program necessary to develop CD8[alpha]+ dendritic cells was more pronounced in PTENfl/fl LysM cre mice. These antigen-presenting cells expressed the immune checkpoint molecules PD-L1 and PD-L2 thereby blocking CD8+ T-cell proliferation ex vivo and in vivo significantly. In the B16-melanoma model myeloid PTEN-deficient mice also exhibited an increase in tumor size. T-cells showed reduced capabilities to lyse tumor cells. Additionally, their T-helper cells showed signs of a regulatory phenotype. Continuing the work on adaptive-immune regulating dendritic cells and the PI3K signaling therein, we used a more DC-specific PTEN knock-out model, the PTENfl/fl CD11c cre mouse. These mice showed an even more severe phenotype than the myeloid PTEN-KO animals in the colon cancer model, with even higher mortality that started already during the inflammatory phase of the model. Additionally, even in acute and chronic colitis models we observed mortality in DC-specific PTEN-KO animals when wildtype controls survived. We found reduced numbers of T-cells in the secondary lymphoid organs of these mice, whereas dendritic cells were increased in numbers and showed an increased expression of co-stimulatory and inhibitory surface molecules. Conversely, T-cells from conditional KOs produced more IFN[gamma] upon re-stimulation. In addition, PTENfl/fl CD11c mice showed an increased bacterial burden during colitis and a concomitant enlargement of the spleen, suggesting that T-cell responses might not be initiated efficiently or are even actively suppressed. In summary, the PI3K/PTEN signaling pathway affects myeloid cell development and polarization. During infection and inflammation, myeloid PTEN-deficient mice show a phenotypic shift in innate cells towards reduced inflammation. This reduced inflammatory response is detrimental during tumor development as immune surveillance is impaired, allowing for an unhindered tumor growth. Our data suggest that blocking PI3K signaling might have additional beneficial effects in cancer treatment by activating tumor immune surveillance via the innate immune system.submitted by Mag. Mario Kuttke, B.Sc.Zusammenfassung in deutscher SpracheMedizinische Universität Wien, Dissertation, 2016OeB

Loss of MAPK-activated protein kinase 2 enables potent dendritic cell-driven anti-tumour T cell response

Abstract Maintaining dendritic cells (DC) in a state of dysfunction represents a key mechanism by which tumour cells evade recognition and elimination by the immune system. Limited knowledge about the intracellular mediators of DC dysfunction restricts success of therapies aimed at reactivating a DC-driven anti-tumour immune response. Using a cell type-specific murine knock-out model, we have identified MAPK-activated protein kinase 2 (MK2) as a major guardian of a suppressive DC phenotype in the melanoma tumour microenvironment. MK2 deletion in CD11c+ cells led to an expansion of stimulatory CD103+ DCs, mounting a potent CD8+ T cell response that resulted in elimination of highly aggressive B16-F10 tumours upon toll-like receptor (TLR) activation in the presence of tumour antigen. Moreover, tumour infiltration by suppressive myeloid cells was strongly diminished. These insights into the regulation of DC functionality reveal MK2 as a targetable pathway for DC-centred immunomodulatory cancer therapies

Oral activity of a nature-derived cyclic peptide for the treatment of multiple sclerosis

Multiple sclerosis (MS) is the most common autoimmune disease affecting the central nervous system. It is characterized by autoreactive T cells that induce demyelination and neuronal degradation. Treatment options are still limited and several MS medications need to be administered by parenteral application but are modestly effective. Oral active drugs such as fingolimod have been weighed down by safety concerns. Consequently, there is a demand for novel, especially orally active therapeutics. Nature offers an abundance of compounds for drug discovery. Recently, the circular plant peptide kalata B1 was shown to silence T-cell proliferation in vitro in an IL-2-dependent mechanism. Owing to this promising effect, we aimed to determine in vivo activity of the cyclotide [T20K]kalata B1 using the MS mouse model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Treatment of mice with the cyclotide resulted in a significant delay and diminished symptoms of EAE by oral administration. Cyclotide application substantially impeded disease progression and did not exhibit adverse effects. Inhibition of lymphocyte proliferation and the reduction of proinflammatory cytokines, in particular IL-2, distinguish the cyclotide from other marketed drugs. Considering their stable structural topology and oral activity, cyclotides are candidates as peptide therapeutics for pharmaceutical drug development for treatment of T-cell-mediated disorders

Sustained PI3K Activation exacerbates BLM-induced Lung Fibrosis via activation of pro-inflammatory and pro-fibrotic pathways

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a life-threatening disease with limited treatment options. Additionally, the lack of a complete understanding of underlying immunological mechanisms underscores the importance of discovering novel options for therapeutic intervention. Since the PI3K/PTEN pathway in myeloid cells influences their effector functions, we wanted to elucidate how sustained PI3K activity induced by cell-type specific genetic deficiency of its antagonist PTEN modulates IPF, in a murine model of bleomycin-induced pulmonary fibrosis (BIPF). We found that myeloid PTEN deficient mice (PTENMyKO), after induction of BIPF, exhibit increased TGF-1 activation, mRNA expression of pro-collagens and lysyl oxidase as well as augmented collagen deposition compared to wild-type littermates, leading to enhanced morbidity and decreased survival. Analysis of alveolar lavage and lung cell composition revealed that PTENMyKO mice exhibit reduced numbers of macrophages and T-cells in response to bleomycin, indicating an impaired recruitment function. Interestingly, we found dysregulated macrophage polarization as well as elevated expression and release of the pro-fibrotic cytokines IL-6 and TNF- in PTENMyKO mice during BIPF. This might point to an uncontrolled wound healing response in which the inflammatory as well as tissue repair mechanisms proceed in parallel, thereby preventing resolution and at the same time promoting extensive fibrosis.(VLID)467447