Involvement of the C terminus in intramolecular nitrogen channeling in glucosamine 6-phosphate synthase: evidence from a 1.6 å crystal structure of the isomerase domain

AbstractBackground: Glucosamine 6-phosphate synthase (GlmS) catalyses the first step in hexosamine metabolism, converting fructose-6P (6 phosphate) into glucosamine-6P using glutamine as a nitrogen source. GlmS is a bienzyme complex consisting of two domains that catalyse glutamine hydrolysis and sugar-phosphate isomerisation, respectively. Knowledge of the three-dimensional structure of GlmS is essential for understanding the general principles of catalysis by ketol isomerases and the mechanism of nitrogen transfer in glutamine amidotransferases.Results: The crystal structure of the isomerase domain of the Escherichia coli GlmS with the reaction product, glucosamine-6P, has been determined at 1.57 å resolution. It is comprised of two topologically identical subdomains, each of which is dominated by a nucleotide-binding motif of a flavodoxin type. The catalytic site is assembled by dimerisation of the protein.Conclusions: The isomerase active site of GlmS seems to be the result of evolution through gene duplication and subsequent dimerisation. Isomerisation of fructose-6P is likely to involve the formation of a Schiff base with Lys603 of the enzyme, the ring-opening step catalysed by His504, and the proton transfer from C1 to C2 of the substrate effected by Glu488. The highly conserved C-terminal fragment of the chain may play a key role in substrate binding, catalysis and communication with the glutaminase domain. The corresponding sequence pattern DXPXXLAK[SC]VT (in single-letter amino-acid code, where X is any amino acid and letters in brackets indicate that either serine or cysteine may take this position) may be considered as a fingerprint of GlmS

Chemical modification of glucosamine-6-phosphate synthase by diethyl pyrocarbonate: Evidence of histidine requirement for enzymatic activity

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Characterization of a Phosphoglucose Isomerase-like Activity Associated with the Carboxy-Terminal Domain of Escherichia coli Glucosamine-6-phosphate Synthase

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Etude du canal responsable du transfert de l'ammoniac au sein de la glucosamine-6P synthase d'E.coli

La Glucosamine-6-phosphate synthase (GlmS) est une enzyme clé de la voie de biosynthèse des hexosamines et appartient à. la famille des amidotransférases glutamine dépendante de classe II. Elle catalyse la transformation du fructose-6-phosphate en glucosamine-6-phosphate en utilisant l'azote amidique de la glutamine comme seule source d'azote. Une structure de la GlmS cristallisée en présence de fructose-6-phosphate a été résolue en 2001 à une résolution de 3,1 Â . Cette structure montre l'existence d'un canal long de 18 Â reliant les deux sites actifs de l enzyme et permettant le transfert de l ammoniac du site glutaminase jusqu'au site accepteur. Cependant, dans cette structure, le canal est fermé par l indole du résidu Trp74 et donc dans une conformation incompatible avec le transfert de l ammoniac. Dans le cadre de l'étude de ce canal, nous avons résolu deux structures de la GlmS, la première en présence de fructose-6-phosphate à une résolution de 2,05 A et la deuxième, à une résolution de 2,35 .Â., en présence de fructose-6-phosphate et.de 6-diazo-5-oxo-norleucine (DON), un inhibiteur irréversible du site glutaminase qui mime un intermédiaire réactionnel de l hydrolyse de la glutamine. Cette deuxième structure nous a permis d observer pour la première fois le canal ammoniac de la GlmS dans une conformation ouverte, le Trp74 participant dans ce cas à la paroi du canal. La comparaison des deux structures a montré que l occupation du site glutaminase par le DON induit une rotation de 75 de l indole du Trp74, permettant l ouverture du canal ammoniac et a révélé les changements de conformations déclenchés par l occupation du site glutaminase, conduisant à l activation de la fonction glutaminase. Nous avons ensuite poursuivi l étude du canal par mutagénèse dirigée en tentant de le perforer. Pour cela, nous avons produit trois mutants de la GlmS où le résidu Trp74 est muté en alanine, leucine ou phénylalanine. Les paramètres cinétiques de ces trois mutants montrent que la majorité de l ammoniac produit par l enzyme est relargué dans le milieu.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

The mechanism of glutamine-dependent amidotransferases

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Affinity Labeling of Escherichia Coli Glucosamine-6-Phosphate Synthase with a Fructose 6-Phosphate Analog. Evidence for Proximity Between the N-Terminal Cysteine and the Fructose-6-Phosphate-Binding Site

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Arabinose-5-phosphate oxime vs its methylenephosphonate mimetic as high energy intermediate of the glucosamine-6P synthase catalyzed reaction

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Crystallization and Preliminary X-ray Analysis of the Two Domains of Glucosamine-6-phosphate Synthase from Escherichia coli

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Nitrogen transfer in E. coli glucosamine-6P synthase. Investigations using substrate and bisubstrate analogs

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