Immunostaining’s characteristics of rat’s olfactory epithelium : development and description of a flat-mounted technique

L'olfaction permet l’analyse des substances chimiques volatiles présentes dans l’air. Le neuroépithélium olfactif (EO) situé dans la cavité nasale est principalement constitué de neurones olfactifs primaires (NOP), cellules réceptrices des molécules odorantes. La cartographie de l’EO au sein des cavités nasales et la densité cellulaire des NOP restent encore imprécises, notamment chez l’Homme. Pourtant, ces informations sont cruciales pour le diagnostic et le traitement des dysosmies. L’immunomarquage sur l’EO monté à plat pourrait être une méthode intéressante pour répondre à ce problème. Dans cette étude, nous avons testé et catégorisé les différents marqueurs des NOP par immunohistochimie (IHC) sur des coupes transversales d’EO. Sur ces coupes, les NOP matures situés dans la partie supérieure de l’EO ont pu être marqués par l’OMP, les NOP immatures dans la partie inférieure de l’EO par DCX, Tuj1 et OLIG2. Tous les NOP montraient un marquage par les anticorps contre LHX2, PGP 9.5 et N-cadhérine. En utilisant les marqueurs présélectionnés par l’étape précédente, en particulier Tuj1 qui montre un marquage intense des dendrites des NOP, nous avons pu développer une technique fiable et simple d’immunomarquage sur l’EO monté à plat qui nous a permis de visualiser une zone de transition nette entre l’EO et l’épithélium respiratoire. Cette technique nous a également permis de compter la densité cellulaire de NOP matures (42080 ± 11820/mm²) et immatures (49384 ± 7134/mm²). Toutes ces expérimentations ont été réalisées sur le modèle expérimental macrosmatique qu’est le rat. Le transfert de cette technique à l’étude de l’EO de l’Homme est la prochaine étape de ce travail.Despite its retaining capacity for neurogenesis, the olfactory epithelium (OE) can be severely damaged. The OE is mainly composed of olfactory sensory neurons (OSNs). The exact topography and cell density of OSNs remains unknown. Immunostaining on flat-mounted OE could be an interesting tool to answer these questions. We report here an extensive characterization of immunohistochemical markers in rat’s transversal sections of OE. We identified LHX2, PGP9.5 and N-cadherin as immunohistochemical markers of all the OSNs; DCX, Tuj1 and OLIG2 as markers of the immature OSNs located in the lower part of the OE and OMP as marker of the mature OSNs located in the upper part of the OE. Tuj1 labelled, with a particular intensity, the OSNs dendrites, at the apical portion of the OE whereas Class IV β-tubulin labelled the upper part of the respiratory epithelium (RE). Using the OSNs markers with the best intensity on rat’s sections of OE, we were able to develop a reliable and easy method of immunostaining on flat-mounted OE. On flat-mounted mucosa, we were able to clearly differentiate OE from RE, with a sharp transition area. We also described the morphology of an OSN, and made a precise evaluation of olfactory cell density: 42080 ± 11820/mm² of mature OSNs and 49384 ± 7134/mm² of immature OSNs. We report here a simple and reliable technique of immunostaining on flat-mounted nasal epithelium. The results obtained extent our knowledge on the spatial organization of the OE and RE in the rat’s nasal cavity. We also give a reliable characterization of the markers in rat’s OE that will enable us to try to translate this easy labelling on flat mounted rat’s mucosa to humans

The impact of iron supplementation for treating anemia in patients with chronic kidney disease: Results from pairwise and network meta-analyses of randomized controlled trials

Producción CientíficaAfter relative erythropoietin deficiency, iron deficiency is the second most important contributing factor for anemia in chronic kidney disease (CKD) patients. Iron supplementation is a crucial part of the treatment of anemia in CKD patients, and intravenous (IV) iron supplementation is considered to be superior to per os (PO) iron supplementation. The differences between the available formulations are poorly characterized. This report presents results from pairwise and network meta-analyses carried out after a comprehensive search in sources of published and unpublished studies, according to the Preferred Reporting Items for Systematic reviews and Meta-Analyses (PRISMA) recommendations (International prospective register of systematic reviews PROSPERO reference ID: CRD42020148155). Meta-analytic calculations were performed for the outcome of non-response to iron supplementation (i.e., hemoglobin (Hgb) increase of 0.8). This study provides parameters for adequately following-up patients requiring iron supplementation, by presenting the most performing preparations, and, indirectly, by making it possible to identify good responders among all patients treated with these medicines

Prévalence des infections à papillomavirus humains oncogènes au sein des carcinomes des voies aéro-digestives supérieures et implication pronostiques

Objectifs : Le rôle des papillomavirus ou HPV (Human Papillomavirus), est maintenant reconnu dans la cancérogenèse des carcinomes épidermoïdes des voies aéro-digestives supérieures (VADS), notamment de l'oropharynx. Pourtant, la fréquence de ces infections reste encore incertaine, variant de 14 à 77% dans la littérature. Cette étude a pour but de rapporter la prévalence des infections à HPV dans les carcinomes des VADS traités au CHU de Saint-Etienne. Nous avons également cherché à comparer le pronostic des patients infectés par l'HPV (HPV+) avec celui des patients non infectés (HPV-). Méthodes : De façon prospective, entre 2007 et 2010, 207 patients ont été inclus dans cette étude. Tous ont subi une panendoscopie et des biopsies pour une tumeur des VADS. Pour chaque biopsie, la présence d'HPV a été testée selon la méthode considérée comme le gold standard : détection et génotypage des HPV par des méthodes moléculaires. La présence des ARNm codant pour les oncoprotéines E6 et E7 des principaux génotypes oncogènes a également été recherchée. Résultats : La présence d'HPV a été retrouvée dans 12% des carcinomes des VADS avec une localisation prédominante au niveau de l'oropharynx (88%). Le typage de ces virus a mis en évidence une forte prépondérance d'un HPV à haut risque oncogène : l HPV16. L'étude de la survie globale et du contrôle loco-régional n'ont pas montré de résultats significatifs mais une tendance à un meilleur pronostic des cancers HPV+. Dans 63,6% des infections à HPV, l ARNm des oncoprotéines E6 et E7 a également été retrouvé, suggérant le rôle actif de ces virus dans la carcinogénèse des VADS. Conclusion : Aujourd'hui, un nouveau facteur de risque est à prendre en compte dans la prise en charge des carcinomes des VADS : les papillomavirus. Le dépistage systématique de cette infection, surtout dans les cancers de l'oropharynx, parait aujourd'hui indispensable. Il pourrait avoir dans un futur proche des implications thérapeutiques importantes.ST ETIENNE-BU Médecine (422182102) / SudocSudocFranceF

Technique of flat-mount immunostaining for mapping the olfactory epithelium and counting the olfactory sensory neurons.

The pathophysiology underlying olfactory dysfunction is still poorly understood, and more efficient biomolecular tools are necessary to explore this aspect. Immunohistochemistry (IHC) on cross sections is one of the major tools to study the olfactory epithelium (OE), but does not allow reliable counting of olfactory sensory neurons (OSNs) or cartography of the OE. In this study, we want to present an easy immunostaining technique to compensate for these defects of IHC. Using the rat model, we first validated and pre-screened the key OSN markers by IHC on cross sections of the OE. Tuj-1, OMP, DCX, PGP9.5, and N-cadherin were selected for immunostaining on flat-mounted OE because of their staining of OSN dendrites. A simple technique for immunostaining on flat-mounted septal OE was developed: fixation of the isolated septum mucosa in 0.5% paraformaldehyde (PFA) preceded by pretreatment of the rat head in 1% PFA for 1 hour. This technique allowed us to correctly reveal the olfactory areas using all the 5 selected markers on septum mucosa. By combining the mature OSN marker (OMP) and an immature OSN marker (Tuj-1), we quantified the mature (OMP+, Tuj-1-), immature (OMP-, Tuj-1+), transitory (OMP+, Tuj-1+) and total OSN density on septal OE. They were respectively 42080 ± 11820, 49384 ± 7134, 14448 ± 5865 and 105912 ± 13899 cells per mm2 (mean ± SD). Finally, the same immunostaining technique described above was performed with Tuj-1 for OE cartography on ethmoid turbinates without flat-mount

Workflow of the macro created for OSN counting.

The different steps of the macro created from the Fiji/imageJ software are shown in the table above. The images (A1 to A6) below are there to help better understand the table. A3: Yellow arrows indicate particle separation. A4: Red arrows indicate the particles with a surface area 2 that are excluded for counting. *The manual inputs include 3 steps: 1.2, 2.1 and 3.1. At completion, ‘OSNs counting’ generates a data table containing the number of green labelled OSNs, the number of red labelled OSNs and the number of colocalized OSNs (A6).</p