Efecto del entrenamiento físico sobre los factores endoteliales en el sistema arterial de conejo

Las enfermedades cardiovasculares constituyen una de las primeras causas de mortalidad en la población occidental y prácticamente el 50% se podrían prevenir con modificaciones del estilo de vida. En este sentido, la práctica regular de ejercicio físico se asocia con una reducción de entre un 20 a un 40% de la incidencia de eventos vasculares primarios y secundarios y del riesgo de muerte por enfermedad cardiovascular. Parte de estos beneficios estarían relacionados con los efectos directos y repetitivos que produce el ejercicio físico sobre la pared vascular, induciendo adaptaciones tanto funcionales como estructurales. Durante el ejercicio hay un aumento significativo del volumen minuto cardiaco, así como una redistribución del gasto cardíaco con un aumento del flujo sanguíneo hacia el músculo esquelético activo, a expensas de una reducción del flujo a los órganos poco activos o inactivos. Estos cambios se atribuyen a variaciones del tono vascular. El tono vascular está regulado por la influencia simultánea de sustancias vasoactivas intravasculares (hormonas y derivados plaquetarios) neurotransmisores (sistema nervioso autónomo perivascular) y la producción de sustancias vasoactivas liberadas por el endotelio. Estudios previos han demostrado que el entrenamiento puede disminuir la actividad simpática tanto en animales como en humanos. Tanto la respuesta al estímulo adrenérgico como la contracción a la noradrenalina se ven disminuidas en el entrenamiento. Esto se traduce en una disminución del tono simpático y a un aumento de la vasodilatación. Las adaptaciones vasculares al entrenamiento se producen por los episodios reiterados de aumento del shear stress, que es la tensión tangencial ejercida sobre el endotelio como resultado del aumento del flujo sanguíneo inducido por el ejercicio, o por la exposición a sustancias humorales como la acetilcolina (Ach). Son tres los mecanismos vasodilatadores de origen endotelial que pueden verse involucrados en el proceso: la prostaciclina (PGI2), procedente del metabolismo del ácido araquidónico, el óxido nítrico (NO) que se sintetiza a partir de la L-arginina, por estimulación de la óxido nítrico sintasa (NOS), y el factor hiperpolarizante derivado del endotelio (EDHF), de estructura desconocida, pero que está estrechamente relacionado con los canales de potasio, principalmente los dependientes del calcio. El predominio de uno u otro mecanismo depende del lecho vascular, de la especie y varía a lo largo del árbol vascular. Además, se han descrito mecanismos de compensación entre ellos cuando se altera el funcionamiento de alguna de las vías. A largo plazo el entrenamiento puede producir una remodelación vascular, aumentando el diámetro de los vasos existentes, modificando la estructura de las diferentes capas del músculo liso vascular o mediante la formación de nuevos vasos capilares a partir de uno ya existente, cambios mediados por el aumento de la liberación de factores de crecimiento vascular endotelial. Estos cambios pueden enmascarar las adaptaciones endoteliales. En base a estos antecedentes, planteamos la hipótesis de que el entrenamiento físico puede mejorar la función endotelial por aumento de los factores relajantes derivados del endotelio. Por consiguiente, el objetivo general del presente trabajo se centró en el estudio de los efectos del ejercicio físico sobre la respuesta vascular y la función endotelial con especial hincapié en la participación de los factores relajantes derivados del endotelio. Para ello hemos caracterizado la respuesta al nitroprusiato sódico, que produce relajación del músculo liso vascular independiente del endotelio, a la acetilcolina, para estudiar la relajación dependiente de endotelio, en ausencia y en presencia de inhibidores de los factores endoteliales, y la respuesta contráctil al cloruro de potasio (KCl), a la endotelina (ET-1) y la respuesta adrenérgica tanto a la noradrenalina (NE) como al estímulo eléctrico (EE). Por último, determinamos los niveles plasmáticos de L-arginina, precursor de la síntesis de NO, de nitratos y nitritos (NOx) como indicadores de la producción de NO, y de NG,NG-dimetil-L-arginina (ADMA), un inhibidor endógeno de la NOS endotelial. Este estudio se realizó comparativamente en conejos entrenados y no entrenados. Debido a la heterogeneidad de las células endoteliales, que implican diferencias en la expresión de receptores, estos mecanismos pueden diferir según el territorio vascular. Por consiguiente el estudio lo hemos desarrollado en tres lechos distintos, en la arteria carótida, como representativa de la circulación cerebral, en la arteria renal, como representante de un lecho en el cual el flujo sanguíneo no aumenta e incluso disminuye durante el ejercicio, y en la arteria femoral, como ejemplo de un vaso de conducción que irriga áreas musculares activas durante el ejercicio. Para la realización de este estudio se han utilizado muestras de conejos macho White New Zealand que fueron divididos en dos grupos. Uno permaneció estabulado durante todo el periodo de entrenamiento mientras que el otro grupo se sometió a un protocolo de entrenamiento físico que consistió en una sesión de entrenamiento diaria, 5 días a la semana durante un total de 6 semanas. Cada sesión de entrenamiento se divide en seis períodos de carrera continua durante 4 minutos con 1 minuto de descanso entre ellos, a una velocidad de 0.33 m/s. Una vez finalizado el periodo de entrenamiento y previo al sacrificio, a cada conejo se le extrajo sangre de la vena marginal de la oreja, para la determinación plasmática de NOx por colorimetría según el método de Griess y de L-arginina y de ADMA mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Tras el sacrificio se extrajeron muestras del sóleo para la determinación de la actividad de la enzima citrato sintasa (CS) por el método de Srere. La actividad de la CS es un marcador de la actividad mitocondrial y se utiliza para valorar la eficiencia del entrenamiento. Asimismo, se tomaron las muestras vasculares, que, una vez limpias, se cortaron en segmentos de 3 mm de longitud para su montaje en un baño de órganos termostatado y carbogenado para el estudio de la reactividad vascular. La actividad de la CS fue un 26% superior en los conejos entrenados, lo cual indica que el protocolo de entrenamiento fue efectivo. En cuanto a la respuesta relajante, el entrenamiento no modificó la respuesta al nitroprusiato sódico en ninguno de los tres lechos vasculares estudiados, lo cual indica que el entrenamiento físico no produjo cambios en la capacidad relajante del músculo liso vascular. La relajación a la acetilcolina en la arteria carótida fue significativamente menor en el grupo de conejos entrenados. Esta menor relajación podría ser debida a que el entrenamiento altere los factores endoteliales. Puesto que la relajación no se modifica en presencia de indometacina, un inhibidor de la COX, no parece haya participación de prostanoides en este lecho vascular. En presencia de L-NAME, un inhibidor exógeno de la NOS, la respuesta relajante a la acetilcolina disminuye tanto en conejos entrenados como en no entrenados, indicando que parte de la respuesta es debida a la liberación de NO. Sin embargo la inhibición es mayor en el grupo no entrenado, por lo cual el entrenamiento disminuye la liberación de NO inducida por acetilcolina. Esta menor liberación de NO podría ser debida a que la modalidad de entrenamiento empleada induzca un incremento del estrés oxidativo debido a un aumento en la producción de radicales libres que conlleve a una menor biodisponibilidad de óxido nítrico. Para valorar la producción de estrés oxidativo inducido por el ejercicio, se realizaron curvas de Ach en ausencia y en presencia de superóxido dismutasa (SOD). La SOD cataliza la reacción del anión superóxido (O2-) en peróxido de hidrogeno (H2O2). Puesto que la SOD no modifica la respuesta a la Ach, no parece que las diferencias de relajación sean debidas a un aumento de radicales libres. Debido a que el NO puede explicar solo en parte la relajación dependiente de endotelio en este vaso, se estudió la respuesta al bloqueo los canales de potasio con KCl, para evaluar si la relajación remanente podía ser explicada por un mecanismo EDHF. El bloqueo con KCl es efectivo, indicando que parte de la relajación es debida a la participación de canales de K+, pero sin diferencias entre grupos. Para evaluar si los canales responsables son los activados por calcio, se incubó con charibdotoxina y apamina, cuya respuesta bloqueante no fue diferente a la producida por el L-NAME, por lo que no hay participación de estos canales en la arteria carótida, y el mecanismo EDHF es en parte atribuible a canales de potasio distintos a los activados por calcio. Finalmente, la relajación remanente se bloquea con ouabaína poniendo de manifiesto la participación de la bomba Na+-K+-ATPasa en la relajación dependiente de endotelio como mecanismo EDHF. En la arteria renal, el ejercicio físico no modifica la respuesta relajante a la Ach. En ambos grupos la respuesta se debe a la participación del NO y de canales de K+. Tanto la relajación mediada por NO como la mediada por canales de K+ es similar en controles y en entrenados. Además, no parece que intervengan los canales de K+ dependientes del Ca+ sensibles a la charibdotoxina y a la apamina. En este lecho la relajación remanente también es bloqueada por la ouabaína. En la arteria femoral, el ejercicio físico tampoco modifica la respuesta relajante a la Ach y tampoco hay participación de los prostanoides en la respuesta relajante dependiente de endotelio. Sin embargo, al igual que en la arteria carótida, la inhibición con L-NAME es menor en el entrenado indicando la menor participación del NO en este grupo. La incubación con charibdotoxina mas apamina produce un mayor bloqueo de la relajación en el grupo de conejos entrenados. En este caso, el aumento compensatorio de la liberación de EDHF cuando la biodisponibilidad de NO está reducida, contribuye al mantenimiento de la vasodilatación dependiente de endotelio. La respuesta contráctil inespecífica se estudió mediante curvas de KCl, cuyo mecanismo de contracción es independiente de receptor e involucra la entrada de calcio a la célula a través de canales de calcio voltaje-dependientes. En la arteria carótida, el entrenamiento disminuyó la sensibilidad al KCl. Esta disminución puede atribuirse a cambios en la estructura de la pared vascular para preservar el flujo sanguíneo cerebral durante el ejercicio. En las arterias renal y femoral, la respuesta contráctil al KCl no se modificó con el entrenamiento. La valoración de la respuesta específica, dependiente de receptor, la hemos estudiado sobre la respuesta adrenérgica por ser uno de los factores que mayor influencia tienen en el mantenimiento del tono vascular. La noradrenalina produce contracción dependiente de la concentración por activación de receptores α1 en las tres arterias estudiadas. El entrenamiento no modifica la respuesta a la noradrenalina en ninguno de los lechos vasculares estudiados. La contracción inducida por el estímulo eléctrico, que está mediada por la liberación de noradrenalina de las terminaciones nerviosas perivasculares, tampoco se modifica con el entrenamiento. Para valorar los efectos sobre receptores no adrenérgicos, se estudió la respuesta a la endotelina, un potente vasoconstrictor cuyos efectos están mediados por la participación de receptores ETa. El entrenamiento tampoco no modifica la respuesta a la endotelina en ninguno de los lechos vasculares estudiados Finalmente, el entrenamiento no modifica los niveles plasmáticos de L-arginina, de nitratos y nitritos, ni de ADMA. Conclusiones: En la arteria carótida, el ejercicio físico crónico disminuye la relajación a la acetilcolina por disminuir la biodisponibilidad de NO. Este efecto se compensa probablemente con cambios estructurales en el músculo liso que disminuyen su capacidad contráctil. En la arteria renal, el ejercicio físico crónico no modifica la respuesta relajante a la acetilcolina ni al nitroprusiato sódico; tampoco afecta a la respuesta contráctil adrenérgica, ni al KCl ni a la endotelina. Por lo tanto, el entrenamiento no parece que afecte al tono vascular ni a la biodisponibilidad del NO en este lecho vascular preservando así la hemodinámica renal y la homeostasia. En la arteria femoral el ejercicio físico crónico disminuye la biodisponibilidad de NO inducida por acetilcolina que se compensa con un aumento de relajación mediada por canales de K+ activados por Ca2+, compatible con una compensación por aumento de EDHF. El ejercicio físico crónico no modifica los niveles plasmáticos de L-arginina, ni de ADMA ni de NOx

Neuronal effects of Sugammadex in combination with Rocuronium or Vecuronium.

Rocuronium (ROC) and Vecuronium (VEC) are the most currently used steroidal non-depolarizing neuromuscular blocking (MNB) agents. Sugammadex (SUG) rapidly reverses steroidal NMB agents after anaesthesia. The present study was conducted in order to evaluate neuronal effects of SUG alone and in combination with both ROC and VEC. Using MTT, CASP-3 activity and Western-blot we determined the toxicity of SUG, ROC or VEC in neurons in primary culture. SUG induces apoptosis/necrosis in neurons in primary culture and increases cytochrome C (CytC), apoptosis-inducing factor (AIF), Smac/Diablo and Caspase 3 (CASP-3) protein expression. Our results also demonstrated that both ROC and VEC prevent these SUG effects. The protective role of both ROC and VEC could be explained by the fact that SUG encapsulates NMB drugs. In BBB impaired conditions it would be desirable to control SUG doses to prevent the excess of free SUG in plasma that may induce neuronal damage. A balance between SUG, ROC or VEC would be necessary to prevent the risk of cell damag

PPARγ as an indicator of vascular function in an experimental model of metabolic syndrome in rabbits

Background and aims: Underlying mechanisms associated with vascular dysfunction in metabolic syndrome (MetS) remain unclear and can even vary from one vascular bed to another. Methods: In this study, MetS was induced by a high-fat, high-sucrose diet, and after 28 weeks, aorta and renal arteries were removed and used for isometric recording of tension in organ baths, protein expression by Western blot, and histological analysis to assess the presence of atherosclerosis. Results: MetS induced a mild hypertension, pre-diabetes, central obesity and dyslipidaemia. Our results indicated that MetS did not change the contractile response in either the aorta or renal artery. Conversely, vasodilation was affected in both arteries in a different way. The aorta from MetS showed vascular dysfunction, including lower response to acetylcholine and sodium nitroprusside, while the renal artery from MetS presented a preserved relaxation to acetylcholine and an increased sensitivity to sodium nitroprusside. We did not find vascular oxidative stress in the aorta from MetS, but we found a significant decrease in PPARγ, phospho-Akt (p-Akt) and phospho-eNOS (p-eNOS) protein expression. On the other hand, we found oxidative stress in the renal artery from MetS, and PPARγ, Akt and p-Akt were overexpressed. No evidence of atherosclerosis was found in arteries from MetS. Conclusions: MetS affects vascular function differently depending on the vessel. In the aorta, it decreases both the vasodilation and the expression of the PPARγ/Akt/eNOS pathway, while in the renal artery, it increases the expression of PPARγ/Akt signalling pathway without decreasing the vasodilation

Glucocorticoid receptor antagonism overcomes resistance to BRAF inhibition in BRAFV600E-mutated metastatic melanoma

Clinical applications of glucocorticoids (GC) in Oncology are dependent on their pro-apoptotic action to treat lymphoproliferative cancers, and to alleviate side effects induced by chemotherapy and/or radiotherapy. However, the mechanism(s) by which GC may also promote tumor progression remains unclear. GC receptor (GR) knockdown decreases the antioxidant protection of highly metastatic B16-F10 melanoma cells. We hypothesize that a GR antagonist (RU486, mifepristone) could increase the efficacy of BRAF-related therapy in BRAFV600E-mutated metastatic melanoma. In vivo formed spontaneous skin tumors were reinoculated into nude mice to expand the metastases of different human BRAFV600E melanoma cells. The GR content of melanoma cell lines was measured by [3H]-labeled ligand binding assay. Nuclear Nrf2 and its transcription activity was investigated by RT-PCR, western blotting, and by measuring Nrf2- and redox state-related enzyme activities and metabolites. GR knockdown was achieved using lentivirus, and GR overexpression by transfection with the NR3C1 plasmid. shRNA-induced selective Bcl-xL, Mcl-1, AKT1 or NF-κB/p65 depletion was used to test the efficacy of vemurafenib (VMF) and RU486 against BRAFV600E-mutated metastatic melanoma. During early progression of skin melanoma metastases, RU486 and VMF induced a drastic metastases regression. However, treatment at an advanced stage of growth demonstrated the development of resistance to RU486 and VMF. This resistance was mechanistically linked to overexpression of specific proteins of the Bcl-2 family (Bcl-xL and Mcl-1 in our experimental models). We found that melanoma resistance is decreased if AKT and NF-κB signaling pathways are blocked. Our results highlight mechanisms by which metastatic melanoma cells adapt to survive

WIN 55,212-2, agonist of cannabinoid receptors, prevents amyloid β1-42 effects on astrocytes in primary culture

Alzheimer´s disease (AD), a neurodegenerative illness involving synaptic dysfunction with extracellular accumulation of Aβ1-42 toxic peptide, glial activation, inflammatory response and oxidative stress, can lead to neuronal death. Endogenous cannabinoid system is implicated in physiological and physiopathological events in central nervous system (CNS), and changes in this system are related to many human diseases, including AD. However, studies on the effects of cannabinoids on astrocytes functions are scarce. In primary cultured astrocytes we studied cellular viability using MTT assay. Inflammatory and oxidative stress mediators were determined by ELISA and Westernblot techniques both in the presence and absence of Aβ1-42 peptide. Effects of WIN 55,212-2 (a synthetic cannabinoid) on cell viability, inflammatory mediators and oxidative stress were also determined. Aβ1-42 diminished astrocytes viability, increased TNF-α and IL-1β levels and p-65, COX-2 and iNOS protein expression while decreased PPAR-γ and antioxidant enzyme Cu/Zn SOD. WIN 55,212-2 pretreatment prevents all effects elicited by Aβ1-42. Furthermore, cannabinoid WIN 55,212-2 also increased cell viability and PPAR-γ expression in control astrocytes. In conclusion cannabinoid WIN 55,212-2 increases cell viability and anti-inflammatory response in cultured astrocytes. Moreover, WIN 55,212-2 increases expression of anti-oxidant Cu/Zn SOD and is able to prevent inflammation induced by Aβ1-42 in cultured astrocytes. Further studies would be needed to assess the possible beneficial effects of cannabinoids in Alzheimer's disease patients

Targeted molecular-genetic imaging and ligand-directed therapy in aggressive variant prostate cancer

Aggressive variant prostate cancers (AVPC) are a clinically defined group of tumors of heterogeneous morphologies, characterized by poor patient survival and for which limited diagnostic and treatment options are currently available. We show that the cell surface 78-kDa glucose-regulated protein (GRP78), a receptor that binds to phage-display-selected ligands, such as the SNTRVAP motif, is a candidate target in AVPC. We report the presence and accessibility of this receptor in clinical specimens from index patients. We also demonstrate that human AVPC cells displaying GRP78 on their surface could be effectively targeted both in vitro and in vivo by SNTRVAP, which also enabled specific delivery of siRNA species to tumor xenografts in mice. Finally, we evaluated ligand-directed strategies based on SNTRVAP-displaying adeno-associated virus/phage (AAVP) particles in mice bearing MDA-PCa-118b, a patient-derived xenograft (PDX) of castration-resistant prostate cancer bone metastasis that we exploited as a model of AVPC. For theranostic (a merging of the terms therapeutic and diagnostic) studies, GRP78-targeting AAVP particles served to deliver the human Herpes simplex virus thymidine kinase type-1 (HSVtk) gene, which has a dual function as a molecular-genetic sensor/reporter and a cell suicide-inducing transgene. We observed specific and simultaneous PET imaging and treatment of tumors in this preclinical model of AVPC. Our findings demonstrate the feasibility of GPR78-targeting, ligand-directed theranostics for translational applications in AVPC

Efficacy and tolerability of EH301 for amyotrophic lateral sclerosis: a randomized, double-blind, placebo-controlled human pilot study

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a devastating neurodegenerative disease, characterized by progressive loss of spinal and cortical motor neurons, leading to muscular atrophy, respiratory failure, and ultimately death. There is no known cure, and the clinical benefit of the two drugs approved to treat ALS remains unclear. Novel disease-modifying therapeutics that are able to modulate the disease course are desperately needed. Our objective was to evaluate the efficacy and tolerability of Elysium Health's candidate drug EH301 in people with ALS (PALS).This was a single-center, prospective, double-blind, randomized, placebo-controlled pilot study. Thirty-two PALS were recruited thanks to the collaboration of the Spanish Foundation for ALS Research (FUNDELA). Study participants were randomized to receive either EH301 or placebo and underwent evaluation for 4 months. Differences between EH301 and placebo-treated participants were evaluated based on standard clinical endpoints, including the revised ALS functional rating scale (ALSFRS-R), forced vital capacity (FVC), and the Medical Research Council (MRC) grading scale.Compared to placebo, participants treated with EH301 demonstrated significant improvements in the ALSFRS-R score, pulmonary function, muscular strength, and in skeletal muscle/fat weight ratio. EH301 was shown to significantly slow the progression of ALS relative to placebo, and even showed improvements in several key outcome measures compared with baseline.This study provides evidence in support of the disease-modifying effects of EH301 for the treatment of ALS.Study Funded by the Catholic University San Vicente Mártir [grant 2017-216-001] and the University of Valencia [grant OTR2017-18255INVES] (Valencia, Spain). Elysium Health, Inc., NY (USA), provided the compounds tested in this study.Medicin

Changes in Chemokines and Chemokine Receptors Expression in a Mouse Model of Alzheimer's Disease

The amyloid precursor protein plus presenilin-1 (APP/PS1) mice are a frequently-used model for Alzheimer's disease studies (AD). However, the data relevant to which proteins are involved in inflammatory mechanism are not sufficiently well-studied using the AD mouse model. Using behavioral studies, quantitative RT-PCR and Western-blot techniques, significant findings were determined by the expression of proteins involved in inflammation comparing APP/PS1 and Wild type mice. Increased GFAP expression could be associated with the elevation in number of reactive astrocytes. IL-3 is involved in inflammation and ABDF1 intervenes normally in the transport across cell membranes and both were found up-regulated in APP/PS1 mice compared to Wild type mice. Furthermore, CCR5 expression was decreased and both CCL3 and CCL4 chemokines were highly expressed indicating a possible gliosis and probably an increase in chemotaxis from lymphocytes and T cell generation. We also noted for the first time, a CCR8 increase expression with diminution of its CCL1 chemokine, both normally involved in protection from bacterial infection and demyelination. Control of inflammatory proteins will be the next step in understanding the progression of AD and also in determining the mechanisms that can develop in this disease

Effects of ranolazine on astrocytes and neurons in primary culture

Ranolazine (Rn) is an antianginal agent used for the treatment of chronic angina pectoris when angina is not adequately controlled by other drugs. Rn also acts in the central nervous system and it has been proposed for the treatment of pain and epileptic disorders. Under the hypothesis that ranolazine could act as a neuroprotective drug, we studied its effects on astrocytes and neurons in primary culture. We incubated rat astrocytes and neurons in primary cultures for 24 hours with Rn (10−7, 10−6 and 10−5 M). Cell viability and proliferation were measured using trypan blue exclusion assay, MTT conversion assay and LDH release assay. Apoptosis was determined by Caspase 3 activity assay. The effects of Rn on proinflammatory mediators IL-β and TNF-α was determined by ELISA technique, and protein expression levels of Smac/Diablo, PPAR-γ, Mn-SOD and Cu/Zn-SOD by western blot technique. In cultured astrocytes, Rn significantly increased cell viability and proliferation at any concentration tested, and decreased LDH leakage, Smac/Diablo expression and Caspase 3 activity indicating less cell death. Rn also increased anti-inflammatory PPAR-γ protein expression and reduced pro-inflammatory proteins IL-1 β and TNFα levels. Furthermore, antioxidant proteins Cu/Zn-SOD and Mn-SOD significantly increased after Rn addition in cultured astrocytes. Conversely, Rn did not exert any effect on cultured neurons. In conclusion, Rn could act as a neuroprotective drug in the central nervous system by promoting astrocyte viability, preventing necrosis and apoptosis, inhibiting inflammatory phenomena and inducing anti-inflammatory and antioxidant agents