Progress and limitations in the development of improved hepatocyte cultures

Um hepatotoxische Effekte neuer Medikamente bereits in einer frühen Phase der Arzneimittelentwicklung detektieren zu können ist die Etablierung von prädiktiven in vitro Modellen erforderlich. Hierzu eignen sich vor allem isolierte PHHs, da diese Zellen mit der in vitro Situation vergleichbare metabolische Eigenschaften aufweisen. Aufgrund unterschiedlicher Ursachen wie beispielsweise einer zu geringen Verfügbarkeit sowie einem raschen Funktionsverlust in Kultur können diese Zellen jedoch bisher für die Testung neuer Medikamente nur begrenzt eingesetzt werden. Als mögliche unbegrenzt verfügbare Alternative kommen unter anderem hepatische Zelllinien in Betracht. Wie unsere Ergebnisse zeigen, eignen sich hepatische Zelllinien wie HepG2 jedoch nur bedingt als Alternative für PHHs. Gründe hierfür sind, dass sie sich nicht nur in ihrem epigenetischen Profil, sondern auch insbesondere in ihren metabolischen Eigenschaften deutlich von den PHH unterscheiden. Durch die getestete epigenetische Reaktivierung mithilfe von AZA und Vitamin C konnten zwar teilweise positive Veränderung der Genexpression erreicht werden, eine mit PHH vergleichbare Genexpression und Aktivität der Fremdstoff-metabolisierenden Enzyme konnten jedoch bei weitem nicht erreicht werden. Auch die Verwendung von PHHs ist wie bereits beschrieben nur eingeschränkt möglich. Um die Verfügbarkeit metabolisch kompetenter PHH zu steigern haben wir daher eine Methode entwickelt, welche es ermöglicht PHHs in einer hohen Konzentration auf engem Raum nahezu verlustfrei von A nach B zu transportieren. Wie unsere Daten weiter zeigen eignet sich das hierfür verwendete Optimaix Scaffold von Matricel jedoch nicht nur als Transport Carrier, sondern ermöglicht auch die Kultivierung metabolisch aktiver PHH über einen Zeitraum von 10 Tagen. Dies bietet die Möglichkeit auch langsame oder verzögerte hepatotoxische Effekte in vitro zu untersuchen. Im Rahmen dieser Arbeit konnten wir zudem pHEMA-BAA basierte Scaffolds entwickeln, welche die Steifigkeiten der gesunden sowie der fibrotisch veränderten Leber repräsentieren. Mithilfe dieser Scaffolds war es möglich krankheitsspezifische Veränderungen der Leber zumindest teilweise zu imitieren. Für solch ein Modell aber insbesondere für noch komplexere Modelle, wie beispielsweise einer Scaffold-basierten 3D Co-Kultur mit Kupffer und/ oder Stellarzellen welche die in vitro Situation noch besser abbilden könnten, konnte eine Methode entwickelt werden, welche die Zelltyp-spezifische Quantifizierung innerhalb solcher Ansätze ermöglicht. Die Verfügbarkeit einer solchen Quantifizierungsmethode ist die Voraussetzung für die Bewertung der in solch komplexen Modellen gewonnen Daten, weil nur so eine Zelltyp-spezifische Evaluation der Effekte möglich ist. Solche Modelle können in Zukunft dazu beitragen in Tierversuchen gewonnen Erkenntnisse besser auf den Menschen übertragen zu können, was es möglich macht die Zahl der Tierversuche zu senken und gleichzeitig die Sicherheit für die Patienten erhöhen.In order to detect the hepatotoxic effects of new drugs at an early stage of drug development, the establishment of predictive in vitro models is necessary. PHH are particularly suitable for this purpose because these cells have metabolic properties comparable to the in vivo situation. However, due to various reasons, such as insufficient availability and rapid loss of function in culture, PHH can only be used to a limited extent for testing new drugs. Among others, hepatic cell lines are considered to be a possible alternative with unlimited availability. However, hepatic cell lines such as HepG2 are only partially suitable as an alternative for PHH, as our results have shown. The reason for this outcome is that they differ significantly from PHH in their epigenetic profile as well as metabolic properties. Although the tested epigenetic reactivation with AZA and vitamin C partially led to positive changes in gene expression of the tested cell lines, comparable gene expression and activity of drug-metaboliszing enzymes to PHH could not be achieved. As already described, the use of PHH is also only possible to a limited extent. In order to increase the availability of metabolically competent PHH, we have developed a method that allows the transport of PHH at high concentrations per area from A to B with almost no loss of viability. As our data further showed, the scaffold used for this purpose is suitable as a transport carrier and enables the cultivation of metabolically active PHH over a period of 10 days. The extension of the possible cultivation time also allows the investigation of delayed toxic effects. This potential is important because hepatotoxicity, for example, as in the case of acetaminophen, is a process that often occurs after a delay (Tolosa et al., 2019, Soldatow et al., 2013). In the course of this thesis, we also developed pHEMA-BAA based scaffolds, whose properties make them ideal for the cultivation of liver cells and additionally represent the stiffness of healthy or the fibrotically altered liver. With these scaffolds, it is possible, at least partially, to imitate disease-specific changes in the liver. Besides, a method has been developed that allows cell type-specific quantification for such a model. This method is also suitable for the quantification of more complex models, such as a scaffold-based 3D co-culture with Kupffer and/or hepatic stellate cells, which can better represent the in vitro situation. In the future, a combination of our scaffold model with such a co-culture approach may contribute to better transfer of observations from animal experiments to humans, thus reducing the number of animal experiments while increasing safety for patients

Progress and limitations in the development of improved hepatocyte cultures

Um hepatotoxische Effekte neuer Medikamente bereits in einer frühen Phase der Arzneimittelentwicklung detektieren zu können ist die Etablierung von prädiktiven in vitro Modellen erforderlich. Hierzu eignen sich vor allem isolierte PHHs, da diese Zellen mit der in vitro Situation vergleichbare metabolische Eigenschaften aufweisen. Aufgrund unterschiedlicher Ursachen wie beispielsweise einer zu geringen Verfügbarkeit sowie einem raschen Funktionsverlust in Kultur können diese Zellen jedoch bisher für die Testung neuer Medikamente nur begrenzt eingesetzt werden. Als mögliche unbegrenzt verfügbare Alternative kommen unter anderem hepatische Zelllinien in Betracht. Wie unsere Ergebnisse zeigen, eignen sich hepatische Zelllinien wie HepG2 jedoch nur bedingt als Alternative für PHHs. Gründe hierfür sind, dass sie sich nicht nur in ihrem epigenetischen Profil, sondern auch insbesondere in ihren metabolischen Eigenschaften deutlich von den PHH unterscheiden. Durch die getestete epigenetische Reaktivierung mithilfe von AZA und Vitamin C konnten zwar teilweise positive Veränderung der Genexpression erreicht werden, eine mit PHH vergleichbare Genexpression und Aktivität der Fremdstoff-metabolisierenden Enzyme konnten jedoch bei weitem nicht erreicht werden. Auch die Verwendung von PHHs ist wie bereits beschrieben nur eingeschränkt möglich. Um die Verfügbarkeit metabolisch kompetenter PHH zu steigern haben wir daher eine Methode entwickelt, welche es ermöglicht PHHs in einer hohen Konzentration auf engem Raum nahezu verlustfrei von A nach B zu transportieren. Wie unsere Daten weiter zeigen eignet sich das hierfür verwendete Optimaix Scaffold von Matricel jedoch nicht nur als Transport Carrier, sondern ermöglicht auch die Kultivierung metabolisch aktiver PHH über einen Zeitraum von 10 Tagen. Dies bietet die Möglichkeit auch langsame oder verzögerte hepatotoxische Effekte in vitro zu untersuchen. Im Rahmen dieser Arbeit konnten wir zudem pHEMA-BAA basierte Scaffolds entwickeln, welche die Steifigkeiten der gesunden sowie der fibrotisch veränderten Leber repräsentieren. Mithilfe dieser Scaffolds war es möglich krankheitsspezifische Veränderungen der Leber zumindest teilweise zu imitieren. Für solch ein Modell aber insbesondere für noch komplexere Modelle, wie beispielsweise einer Scaffold-basierten 3D Co-Kultur mit Kupffer und/ oder Stellarzellen welche die in vitro Situation noch besser abbilden könnten, konnte eine Methode entwickelt werden, welche die Zelltyp-spezifische Quantifizierung innerhalb solcher Ansätze ermöglicht. Die Verfügbarkeit einer solchen Quantifizierungsmethode ist die Voraussetzung für die Bewertung der in solch komplexen Modellen gewonnen Daten, weil nur so eine Zelltyp-spezifische Evaluation der Effekte möglich ist. Solche Modelle können in Zukunft dazu beitragen in Tierversuchen gewonnen Erkenntnisse besser auf den Menschen übertragen zu können, was es möglich macht die Zahl der Tierversuche zu senken und gleichzeitig die Sicherheit für die Patienten erhöhen.In order to detect the hepatotoxic effects of new drugs at an early stage of drug development, the establishment of predictive in vitro models is necessary. PHH are particularly suitable for this purpose because these cells have metabolic properties comparable to the in vivo situation. However, due to various reasons, such as insufficient availability and rapid loss of function in culture, PHH can only be used to a limited extent for testing new drugs. Among others, hepatic cell lines are considered to be a possible alternative with unlimited availability. However, hepatic cell lines such as HepG2 are only partially suitable as an alternative for PHH, as our results have shown. The reason for this outcome is that they differ significantly from PHH in their epigenetic profile as well as metabolic properties. Although the tested epigenetic reactivation with AZA and vitamin C partially led to positive changes in gene expression of the tested cell lines, comparable gene expression and activity of drug-metaboliszing enzymes to PHH could not be achieved. As already described, the use of PHH is also only possible to a limited extent. In order to increase the availability of metabolically competent PHH, we have developed a method that allows the transport of PHH at high concentrations per area from A to B with almost no loss of viability. As our data further showed, the scaffold used for this purpose is suitable as a transport carrier and enables the cultivation of metabolically active PHH over a period of 10 days. The extension of the possible cultivation time also allows the investigation of delayed toxic effects. This potential is important because hepatotoxicity, for example, as in the case of acetaminophen, is a process that often occurs after a delay (Tolosa et al., 2019, Soldatow et al., 2013). In the course of this thesis, we also developed pHEMA-BAA based scaffolds, whose properties make them ideal for the cultivation of liver cells and additionally represent the stiffness of healthy or the fibrotically altered liver. With these scaffolds, it is possible, at least partially, to imitate disease-specific changes in the liver. Besides, a method has been developed that allows cell type-specific quantification for such a model. This method is also suitable for the quantification of more complex models, such as a scaffold-based 3D co-culture with Kupffer and/or hepatic stellate cells, which can better represent the in vitro situation. In the future, a combination of our scaffold model with such a co-culture approach may contribute to better transfer of observations from animal experiments to humans, thus reducing the number of animal experiments while increasing safety for patients

Development of scaffolds with adjusted stiffness for mimicking disease-related alterations of liver rigidity

Drug-induced liver toxicity is one of the most common reasons for the failure of drugs in clinical trials and frequent withdrawal from the market. Reasons for such failures include the low predictive power of in vivo studies, that is mainly caused by metabolic differences between humans and animals, and intraspecific variances. In addition to factors such as age and genetic background, changes in drug metabolism can also be caused by disease-related changes in the liver. Such metabolic changes have also been observed in clinical settings, for example, in association with a change in liver stiffness, a major characteristic of an altered fibrotic liver. For mimicking these changes in an in vitro model, this study aimed to develop scaffolds that represent the rigidity of healthy and fibrotic liver tissue. We observed that liver cells plated on scaffolds representing the stiffness of healthy livers showed a higher metabolic activity compared to cells plated on stiffer scaffolds. Additionally, we detected a positive effect of a scaffold pre-coated with fetal calf serum (FCS)-containing media. This pre-incubation resulted in increased cell adherence during cell seeding onto the scaffolds. In summary, we developed a scaffold-based 3D model that mimics liver stiffness-dependent changes in drug metabolism that may more easily predict drug interaction in diseased livers

Hepatic Osteodystrophy—Molecular Mechanisms Proposed to Favor Its Development

Almost all patients with chronic liver diseases (CLD) show altered bone metabolism. Depending on the etiology, this manifests in a severe osteoporosis in up to 75% of the affected patients. Due to high prevalence, the generic term hepatic osteodystrophy (HOD) evolved, describing altered bone metabolism, decreased bone mineral density, and deterioration of bone structure in patients with CLD. Once developed, HOD is difficult to treat and increases the risk of fragility fractures. Existing fractures affect the quality of life and, more importantly, long-term prognosis of these patients, which presents with increased mortality. Thus, special care is required to support the healing process. However, for early diagnosis (reduce fracture risk) and development of adequate treatment strategies (support healing of existing fractures), it is essential to understand the underlying mechanisms that link disturbed liver function with this bone phenotype. In the present review, we summarize proposed molecular mechanisms favoring the development of HOD and compromising the healing of associated fractures, including alterations in vitamin D metabolism and action, disbalances in transforming growth factor beta (TGF-β) and bone morphogenetic protein (BMP) signaling with histone deacetylases (HDACs) as secondary regulators, as well as alterations in the receptor activator of nuclear factor kappa B ligand (RANKL)–osteoprotegerin (OPG) system mediated by sclerostin. Based on these mechanisms, we give an overview on the limitations of early diagnosis of HOD with established serum markers