Einsatz humaner Stammzellen für die kardiale und osteogene Geweberegeneration

Die Regenerative Medizin ist eines der vielversprechendsten Forschungsgebiete für die zukünftige Behandlung von Krankheiten, für die bisher noch keine oder nicht ausreichende Behandlungsmöglichkeiten zur Verfügung stehen. Ziel der regenerativen Medizin ist, einen durch Krankheit oder Gendefekt ausgelösten Funktionsverlust von einzelnen Zellen, Geweben oder ganzen Organen zu kompensieren oder gänzlich zu therapieren. Ein limitierender Faktor war hierbei der Mangel an patientenspezifischen Zellen, sowie die Nachbildung dreidimensionaler Gewebestrukturen, die eine erfolgreiche Integration der eingesetzten Implantate gewährleistet. Durch die Kombination verschiedener Fachgebiete, wie der Molekular- und Zellbiologie mit dem Tissue Engineering und der Biomaterialforschung, konnten in den letzten Jahrzehnten jedoch enorme Fortschritte erzielt werden. Insbesondere die Entdeckung und die Forschung an mesenchymalen- und pluripotenten Stammzellen, sowie die Möglichkeit aus somatischen Zellen iPSCs (Induced pluripotent stem cells) zu generieren, hat eine nahezu unerschöpfliche Quelle an patientenspezifischen Zellen hervorgebracht. Damit hiPSCs (human iPSCs) in einer klinischen Anwendung zum Einsatz kommen können, muss die Sicherheit der Zellen jedoch gewährleistet und eine Reaktivierung der Reprogrammierungsfaktoren nach der Implantation im Patienten ausgeschlossen werden. Im Rahmen dieser Arbeit, wurde eine nicht-integrative synthetische srRNA (Self replicating RNA) verwendet, um RECs (Renal epithelial cells) zu hiPSCs zu reprogrammieren. Die Behandlung mit B18R Protein ermöglichte eine gezielte Steuerung der zellulären Typ-I-IFN (Interferon) Antwort und die erfolgreiche Reprogrammierung der Zellen. In den generierten hiPSCs konnten keine srRNA-Rückstände oder chromosomale Aberrationen festgestellt werden. Zudem wiesen sie typische Charakteristika pluripotenter Stammzellen auf, wie unter anderem die Fähigkeit in Zellen der drei Keimbahnen Mesoderm, Endoderm und Ektoderm zu differenzieren. Neben in vitro Untersuchungen konnte dies in einem erstmals hierfür eingesetzten alternativen Tiermodell auf der CAM (Chorion-allantoic membran) von befruchteten Hühnereiern gezeigt werden. Im weiteren Verlauf dieser Arbeit, konnten die aus RECs generierten hiPSCs zu kontrahierenden Kardiomyozyten differenziert werden. Nach einer ausführlichen Charakterisierung der differenzierten Kardiomyozyten über spezifische Marker-Proteine und das Ansprechen auf die Kalziumkanal-Modulatoren Nifedipin und Isoproterenol, wurde die Applikation der Zellen für einen potenziellen Einsatz nach einem Myokardinfarkt ex-vivo in Schweineherzen untersucht. Hierbei konnte gezeigt werden, dass eine neuartige wasserstrahlbasierte Zellapplikationsmethode zu einer verbesserten räumlichen Verteilung im Myokard, bei einem ausschließlich geringen Verlust an Viabilität der applizierten Zellen, im Vergleich zu einer Nadelinjektion führt. Des Weiteren konnte mittels wasserstrahlbasierter Applikationsmethode eine unerwünschte Verteilung der Zellen in den Koronararterien deutlich reduziert werden. Dadurch könnte die Gefahr einer Stenose, die bei einer Injektion der Kardiomyozyten in die Herzkranzgefäße gegeben ist, gesenkt werden. Ein vielversprechendes Einsatzgebiet in der regenerativen Medizin von mesenchymalen Stammzellen ist die Regeneration von Knochen im Bereich der Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie. Um die osteogene Regeneration zu unterstützen, werden diese Zellen in Kombination mit Biomaterialien eingesetzt. Teil dieser Arbeit war, aus dem Kieferperiost isolierte mesenchymale Stammzellen, sogenannte JPCs (Jaw periosteal cells), auf einem β-TCP (β-Tri-Calcium-Phosphat)-Trägermaterial auszusäen und ihre osteogene Differenzierungskapazität zu analysieren. Zusätzlich sollte nach dem Kontakt mit Blut ein möglicher Einfluss der zellbesiedelten Konstrukte auf die Hämostase untersucht werden. Die Untersuchungen zeigten, dass PLGA (Polylactid-co-Glycolid)-beschichtete und unbeschichtete β-TCP-Gerüste mit JPCs besiedelt und weiter in osteogene Zellen differenziert werden können. Die Inkubation dieser Konstrukte mit humanem Vollblut zeigten eine Erhöhung des Gerinnungsmarkers TAT (Thrombin-Antithrombin-III-Komplex) sowie eine Anhäufung von Fibrinfasern auf den mit JPC besiedelten β-TCP-Gerüsten im Vergleich zu den Gerüsten ohne Zellen. Diese Studie zeigte, dass neben dem Biomaterial auch die darauf ausgesäten Zellen die Hämostase beeinflussen und somit die osteogene Regeneration beeinflussen können. Der Einsatz von patientenspezifischen mesenchymalen und pluripotenten Stammzellen eröffnet enorme Möglichkeiten im Bereich der regenerativen Medizin. So können mesenchymale und mittels srRNA generierte pluripotente Stammzellen zu autologen Gewebezellen differenziert werden und zur Zelltherapie oder Generierung 3-dimensionaler Gewebekonstrukte eingesetzt werden. Dadurch kann zukünftig die Regeneration von Geweben und eine Behandlung von bisher nicht oder nicht vollständig heilbaren Krankheiten ermöglicht werden

Development of an In Vitro Blood Vessel Model Using Autologous Endothelial Cells Generated from Footprint-Free hiPSCs to Analyze Interactions of the Endothelium with Blood Cell Components and Vascular Implants

Cardiovascular diseases are the leading cause of death globally. Vascular implants, such as stents, are required to treat arterial stenosis or dilatation. The development of innovative stent materials and coatings, as well as novel preclinical testing strategies, is needed to improve the bio- and hemocompatibility of current stents. In this study, a blood vessel-like polydimethylsiloxane (PDMS) model was established to analyze the interaction of an endothelium with vascular implants, as well as blood-derived cells, in vitro. Using footprint-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) and subsequent differentiation, functional endothelial cells (ECs) expressing specific markers were generated and used to endothelialize an artificial PDMS lumen. The established model was used to demonstrate the interaction of the created endothelium with blood-derived immune cells, which also allowed for real-time imaging. In addition, a stent was inserted into the endothelialized lumen to analyze the surface endothelialization of stents. In the future, this blood vessel-like model could serve as an in vitro platform to test the influence of vascular implants and coatings on endothelialization and to analyze the interaction of the endothelium with blood cell components

A Human Whole Blood Culture System Reveals Detailed Cytokine Release Profiles of Implant Materials.

INTRODUCTION Common in vitro cell culture systems for testing implant material immune compatibility either rely on immortal human leukocyte cell lines or isolated primary cells. Compared to in vivo conditions, this generates an environment of substantially reduced complexity, often lacking important immune cell types, such as neutrophil granulocytes and others. The aim of this study was to establish a reliable test system for in vitro testing of implant materials under in vivo-like conditions. METHODS Test materials were incubated in closed, CO2-independent, tube-based culture vessels containing a proprietary cell culture medium and human whole blood in either a static or occasionally rotating system. Multiplex cytokine analysis was used to analyze immune cell reactions. RESULTS To demonstrate the applicability of the test system to implant materials, three commercially available barrier membranes (polytetrafluoroethylene (PTFE), polycaprolactone (PCL) and collagen) used for dental, trauma and maxillofacial surgery, were investigated for their potential interactions with immune cells. The results showed characteristic differences between the static and rotated incubation methods and in the overall activity profiles with very low immune cell responses to PTFE, intermediate ones to collagen and strong reactions to PCL. CONCLUSION This in vitro human whole blood model, using a complex organotypic matrix, is an excellent, easily standardized tool for categorizing immune cell responses to implant materials. Compared to in vitro cell culture systems used for materials research, this new assay system provides a far more detailed picture of response patterns the immune system can develop when interacting with different types of materials and surfaces

Generation of iPSCs from Jaw Periosteal Cells Using Self-Replicating RNA

Jaw periosteal cells (JPCs) represent a suitable stem cell source for bone tissue engineering (BTE) applications. However, challenges associated with limited cell numbers, stressful cell sorting, or the occurrence of cell senescence during in vitro passaging and the associated insufficient osteogenic potential in vitro of JPCs and other mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) are main hurdles and still need to be solved. In this study, for the first time, induced pluripotent stem cells (iPSCs) were generated from human JPCs to open up a new source of stem cells for BTE. For this purpose, a non-integrating self-replicating RNA (srRNA) encoding reprogramming factors and green fluorescent protein (GFP) as a reporter was used to obtain JPC-iPSCs with a feeder- and xeno-free reprogramming protocol to meet the highest safety standards for future clinical applications. Furthermore, to analyze the potential of these iPSCs as a source of osteogenic progenitor cells, JPC-iPSCs were differentiated into iPSC-derived mesenchymal stem/stromal like cells (iMSCs) and further differentiated to the osteogenic lineage under xeno-free conditions. The produced iMSCs displayed MSC marker expression and morphology as well as strong mineralization during osteogenic differentiation