Efeito do ácido fólico e da homocisteína sobre os processos de proliferação e diferenciação celular no telencéfalo de embriões de Gallus domesticus

TCC(graduação) - Universidade Federal de Santa Catarina. Centro de Ciências Biológicas. Biologia.Micronutrientes são vitaminas e minerais obtidos da dieta, necessários para o crescimento, manutenção e reprodução dos indivíduos. O ácido fólico (AF) é uma vitamina do complexo B, que participa de importantes reações metabólicas, como a biossíntese de compostos essenciais. Sua deficiência está associada a elevados índices plasmáticos de homocisteína (Hcy), que ao se acumular intracelularmente, pode provocar defeitos de tubo neural (DTN). Neste estudo foi avaliado o efeito do AF e da Hcy sobre os processos de proliferação e diferenciação celular no telencéfalo de embriões de gallus domesticus. Para tal, ovos fertilizados de G. domesticus foram incubados a 38°C e a 65% de umidade, sendo os tratamentos realizados após 24 e 46 horas de incubação. Foram organizados grupos experimentais, como segue: controle - 50 μl salina (24 horas de incubação)+50 μl salina (46 horas de incubação); AF - 50 μl salina (24 horas de incubação)+0.5 μg AF (46 horas de incubação); Hcy - 50 μl salina (24 horas de incubação)+20 μmol Hcy (46 horas de incubação); AF+Hcy - 0.5 μg AF (24 horas de incubação)+20 μmol Hcy (46 horas de incubação). Após, os ovos foram selados com fita não tóxica e retornaram para a estufa, permanecendo até o sexto dia embrionário (E6), quando os embriões foram retirados dos ovos e preparados para as análises posteriores. Foram realizadas análises morfométricas das vesículas encefálicas e das camadas do telencéfalo (ependimária, manto e marginal). Técnicas de imuno-histoquímica foram utilizadas para avaliar a proliferação celular, diferenciação neuronal e glial, através dos anticorpos: anti-fosfohistona H3 (proliferação celular); anti–β tubulina III (diferenciação neuronal) e anti-GFAP (diferenciação glial). A morfometria da região cefálica demonstrou pouca variação entre os tratamentos realizados. Do mesmo modo, não foram observadas alterações na espessura das camadas do telencéfalo. Nos embriões tratados com Hcy verificou-se uma redução significativa da proliferação celular na camada ependimária. Na diferenciação neuronal, a Hcy interferiu na diferenciação dos neurônios, interferindo também na migração neuronal. Adicionalmente, verificou-se que o tratamento com Hcy interferiu na diferenciação dos astrócitos, aumentando sua expressão, conduzindo a uma resposta conhecida como gliose reativa. Os resultados demonstram que, embora a Hcy não tenha comprometido o crescimento das vesículas encefálicas e das camadas celulares do telencéfalo, induziu alterações nos processos de proliferação celular e de diferenciação neuronal e glial em G. domesticus.Micronutrients are vitamins and minerals obtained from the diet required for growth, maintenance and reproduction of individuals. Folic acid (FA) is an B vitamin that participates in important metabolic reactions, such as the biosynthesis of essential compounds. FA nutritional deficiency produces an increase in homocysteine (Hcy) levels, and can cause neural tube defects (DTN). In this study we evaluated the effect of FA and Hcy in processes of cell proliferation and differentiation in the telencephalon of embryos of Gallus domesticus. Fertilized eggs of G. domesticus were incubated at 38 ° C and 65% humidity, and treatments were performed after 24 and 46 hours of incubation. The experimental groups were organized as follows: control - 50 μl saline (24 hours incubation) + 50 μl saline (46 hours incubation); AF- 50 μl saline (24 hours incubation) + 0.5 μg AF (46 hours incubation); Hcy- 50 μl salina (24 hours incubation) + 20 μmol Hcy (46 hours incubation); AF+Hcy - 0.5 μg AF (24 hours incubation) + 20 μmol Hcy (46 hours incubation. After, the egg’s was sealed with non-toxic tape and returned to the incubator until the sixth embryonic day (E6). Thus the embryos were removed from eggs and prepared for further analysis. Morphometry of head and layers of telencephalon were performed. Immunohistochemistry were used to evaluate the cell proliferation, differentiation, neuronal and glial cell using the antibodie: anti-phosphohistona H3 (cell proliferation), anti-β tubulin III (neuronal differentiation) and anti-GFAP (glial differentiation). The morphology of cephalic region showed little variation among the treatments. Similarly, no changes were observed in the thickness of the layers of the telencephalon. Embryos treated with Hcy showed a significant reduction in cell proliferation in ependymal layer. Hcy caused disruptions in neuronal differentiation and migration. Additionally, it was found that treatment with Hcy interfer with the differentiation of astrocytes, increasing GFAP expression, leading to an astrocytic response known as reactive gliosis. These results demonstrate that, although Hcy has not compromised growth and brain vesicles layers of the telencephalon, induced significant changes in the processes of cell proliferation and in the differentiation of the neurons and glia in G. domesticus embryos

Efeito da homocisteína sobre a expressão de proteínas relacionadas ao ciclo celular à diferenciação neural durante o desenvolvimento de Gallus domesticus

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2015.Elevados níveis do aminoácido homocisteína (Hcy) são caracterizados como uma desordem metabólica denominada - hiperhomocisteinemia, a qual está envolvida com a ocorrência de anomalias congênitas. No sistema nervoso central (SNC) especificamente, esta condição está associada ao dano ao DNA, citotoxicidade neuronal, estresse oxidativo e prejuízo na síntese de neurotransmissores. Neste estudo, foi avaliado o efeito da dose alta de Hcy sobre a expressão das proteínas do ciclo celular, diferenciação e sobrevivência neural. Adicionalmente, investigamos o efeito da Hcy sobre a ultraestrutura das células do mesencéfalo em embriões de Gallus domesticus. Para tal, os embriões foram tratados com 48 horas de incubação (E2) onde foram organizados dois grupos experimentais: controle - 50 µl salina e Hcy - 20 µmol Hcy/50 µl salina. Os embriões foram analisados em duas idades - E6 e E10. Através da técnica de imuno-histoquímica, verificou-se uma redução significativa da proliferação celular na camada ependimária do mesencéfalo nos embriões em E6. A avaliação da expressão das demais proteínas envolvidas no ciclo celular como p53, p21, ciclina E e PCNA foi realizada pela combinação das técnicas de citometria de fluxo e imuno-histoquímica. O tratamento com Hcy induziu um aumento na expressão da proteína p53, e uma diminuição na expressão das proteínas p21 e ciclina E. Para as proteínas envolvidas no processo apoptótico, como BCL2 e BAK, não foram encontradas diferenças significativas nas duas idades analisadas. Na análise da diferenciação neural encontramos um aumento significativo na expressão da proteína GFAP em E6, o que caracterizamos como um processo de resposta celular denominado gliose reativa. Porém, esta resposta foi normalizada nos embriões na idade E10. Para a análise de sobrevivência neural, houve uma redução na expressão de BDNF e GDNF nos embriões expostos à Hcy na idade de E6. Por fim, através da técnica de microscopia eletrônica de transmissão, a análise ultraestrutural das células revelou alterações relacionadas ao espaço perinuclear e a formação anômala de membrana nos embriões expostos à Hcy nas idades de E6 e E10. Os resultados demonstram que, embora a Hcy não tenha induzido anomalias congênitas aparentes no SNC, o tratamento comprometeu os processos de proliferação celular, diferenciação glial e sobrevivência neural em G. domesticus.Abstract : High levels of amino acid homocysteine (Hcy) are characterized as a metabolic disorder named hyperhomocysteinemia, which is related to the occurrence of congenital anomalies. Specifically in the nervous system (CNS), this condition is associated with DNA damage, neuronal cytotoxicity, oxidative stress and impaired neurotransmitter synthesis. This study evaluated the effect of Hcy on the expression of cell cycle proteins, neuronal differentiation and survival. Additionally we investigated the effect of Hcy on the ultrastructure of midbrain in embryos aged E6 and E10. Thus, fertilized eggs of Gallus domesticus were treated at 48 hours of incubation (E2). Two experimental groups were organized: Control - 50 µl saline and Hcy - 20 µmol Hcy/50 µl saline. Embryos were analyzed at two embryonic ages - E6 and E10. Immunohistochemistry showed a significant reduction in expression cell proliferation in the ependymal layer of the midbrain at E6. Evaluation of expression of the other proteins involved in cell cycle such as p53, p21, cyclin E and PCNA were performed by the combination of flow cytometry and immunohistochemistry Hcy treatment induced an increase in p53 expression, and a decrease in the expression of the proteins p21 and cyclin E. Proteins involved in apoptosis, as BCL2 and BAK, not showed significant differences in both ages examined. The analysis of neural differentiation found a significant increase in protein expression GFAP at E6, which characterized as a process of cellular response termed reactive gliosis, but this response was standardized at E10. The quantification of the proteins neuronal survival BDNF and GDNF were quantified by flow cytometry and a significant reduction was found in embryos exposed to Hcy at E6, and this pattern is reversed at E10. Finally, by technique of transmission electron microscopy, the ultrastructural analysis of the cells showed changes related to the perinuclear space and the anomalous formation of membrane in embryos exposed to Hcy at E6 and E10. The results demonstrated that although Hcy did not induce congenital anomalies in the CNS, the treatment impaired the cellular processes of proliferation, differentiation glial and neuronal survival in G. domesticus

Toxicidade da homocisteína no desenvolvimento das vesículas ópticas em embriões de Gallus domesticus

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2019.Elevados níveis do aminoácido homocisteína (Hcy) são caracterizados como uma desordem metabólica denominada ? hiperhomocisteinemia, a qual está envolvida com a ocorrência de anomalias congênitas, principalmente no sistema nervoso central (SNC). Entretanto, os efeitos da Hcy durante o desenvolvimento das vesículas ópticas, sobretudo a retina, ainda não foram elucidados. O objetivo deste estudo foi caracterizar o efeito da elevada dose de Hcy durante o desenvolvimento das vesículas ópticas, utilizando como modelo experimental o embrião de Gallus domesticus. Ovos fertilizados de G. domesticus foram incubados (38°C) e tratados após 48 horas de incubação (E2). Foram organizados dois grupos experimentais: Controle - 50 µL salina; Hcy - 20 µmol Hcy/50 µL salina. As Análises foram realizadas nas vesículas ópticas dos embriões nas idades de E6 e E10. A Hcy reduziu a sobrevivência dos embriões nas duas idades de análise. Em E6 e E10 foi observado o aumento dos fatores vasculogênicos VEGF e VCAM, promovendo danos à integridade dos vasos sanguíneos. Proliferação e diferenciação neuronal foram reduzidas em E6 e E10 nos embriões tratados com Hcy, porém ocorreu uma maior modulação das proteínas envolvidas com a progressão e parada do ciclo na idade de E6. Dano ao DNA foi reconhecido apenas nos embriões tratados com Hcy em E6. Nas análises ultraestruturais, embriões tratados com Hcy apresentaram alterações como dilatação do envoltório nuclear, alterações mitocôndrias equivalentes a edemas, ruptura de membranas e de crista. No citoplasma foi observada a formação de membranas concêntricas e vesículas. Na idade de E10, além destas mesmas alterações, foi verificada a dilatação das cisternas do retículo endoplasmático nos embriões tratados com Hcy. A análise da dinâmica mitocondrial revelou o aumento da proteína Drp1 (fissão mitocondrial) e diminuição das proteínas Mfn1 e Mfn2 (fusão mitocondrial), nos embriões tratados com Hcy em E6 e E10. Essas alterações nas proteínas envolvidas com a dinâmica mitocondrial promoveram o aumento do número de perfis mitocondriais, bem como a redução da área destes, na idade de E10. Além disso, a Hcy reduziu a viabilidade celular nas duas idades de análise, mostrando seu efeito citotóxico principalmente para as mitocôndrias. Por fim, as alterações celulares encontradas nos embriões tratados com Hcy induziram dois mecanismos de resposta celular: autofagia, avaliada pela marcação com LC3II e apoptose, identificada pelo aumento de caspase-3 nos embriões em E10.Abstract: High levels of amino acid homocysteine (Hcy) are characterized as a metabolic disorder named hyperhomocysteinemia, which is related to the occurrence of congenital anomalies, mainly in the nervous system (CNS). However, the effects of Hcy during the development of optic vesicles, especially the retina, have not been understood. The aim of this study was to characterize the effect of the high doses of Hcy during the development of the optical vesicles, using as an experimental model the embryo of Gallus domesticus. Fertilized eggs of G. domesticus were incubated (38 ° C), and treated after 48 hours of incubation (E2). Two experimental groups were organized: Control - 50 µl saline; Hcy - 20 µmol Hcy/50 µl saline. Embryos were analyzed at E6 and E10. Hcy reduced the survival of the embryos at both analysis ages. Increased vasculogenic factors VEGF and VCAM were observed at E6 and E10, promoting damage to the integrity of blood vessels. Proliferation and neuronal differentiation were reduced at E6 and E10 in the Hcy-treated embryos, however there was a greater modulation of the proteins involved with the progression and stopping of the cell cycle at E6. DNA damage was confirmed only in Hcy-treated embryos at E6. In ultrastructural analyses, embryos treated with Hcy showed alterations such as nuclear envelope dilation, mitochondrial alterations equivalent to edema, rupture of membranes and cristae. In the cytoplasm we observed the formation of concentric membranes and vesicles. At E10, in addition to these same alterations, dilation of the endoplasmic reticulum cisternae was verified in embryos treated with Hcy. The analysis of mitochondrial dynamics revealed the increase of Drp1 (mitochondrial fission) and decrease of Mfn1 and Mfn2 (mitochondrial fusion), in embryos treated with Hcy at E6 and E10. These changes in the proteins involved with the mitochondrial dynamics promoted an increase in the number of mitochondrial profiles as well as the reduction of the mitochondrial area at E10. In addition, Hcy reduced cell viability at both analysis ages, showing its cytotoxic effect mainly in mitochondria. Finally, cellular changes found in Hcy-treated embryos induced two cellular response mechanisms: autophagy, assessed by LC3II labeling and apoptosis, identified by the increase of caspase-3 in E10 embryos

Inclusion of copepod Acartia tonsa nauplii in the feeding of Centropomus undecimalis larvae increases stress resistance

This research represents the first result of studies of the common snook Centropomus undecimalis larvae from broodstock matured in captivity in Brazil. The aim of this study was to evaluate if the inclusion of Acartia tonsa nauplii improves stress resistance of common snook larvae. The larvae were fed with: rotifers Brachionus plicatilis (10 to 15 mL-1); A. tonsa nauplii (0.25 to 0.5 mL-1) and rotifers (5 to 7.5 mL-1), and A. tonsa nauplii (0.12 to 0.25 mL-1). The average percentage of survival of the treatments was 11.9%. At 20 days of age, larvae were subjected to thermal stress. Subsequently, the stress resistance was evaluated. Common snook larvae fed B. plicatilis+A. tonsa reached a higher weight and length (7.5 ± 0.00 mg and 9.1 ± 0.23 mm, respectively) and resisted more heat stress (87.4%) than larvae fed other foods, indicating that the feed mixture is satisfactory as a starter diet for larvae of common snook. However, more research is needed to confirm these results