Hidrólise da lactose e síntese de galactooligossacarídeos utilizando B-galactosidase imobilizada em suportes à base de quitosana

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos, Florianópolis, 2014.A ß-galactosidase (E.C 3.2.1.23) é uma das enzimas mais empregadas na indústria de alimentos sendo principalmente utilizada na hidrólise da lactose para obtenção de produtos com baixo teor de lactose e na síntese de galactooligossacarídeos (GOS). A imobilização desta e outras enzimas é uma forma eficaz de permitir o reuso do biocatalisador e aumentar sua estabilidade térmica. Esta imobilização pode ser feita em suportes à base de quitosana, pois, além de serem seguros, possuem grupos funcionais que permitem a imobilização direta ou a modificação com outros grupos funcionais de interesse. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi estudar a hidrólise da lactose e a síntese de GOS utilizando a ß-galactosidase imobilizada em suportes à base de quitosana. Primeiramente, macro e nanopartículas de quitosana foram obtidas, caracterizadas e utilizadas para a imobilização da ß-galactosidase de Kluyveromyces lactis. Avaliou-se a carga de enzima imobilizada em cada um dos suportes, bem como a estabilidade térmica e operacional do biocatalisador imobilizado. Subsequentemente, as macropartículas de quitosana foram utilizadas em um reator de leito fixo a fim de avaliar a hidrólise da lactose e a síntese de GOS em sistema contínuo. A imobilização da ß-galactosidase de Aspergillus oryzae em macropartículas de quitosana foi realizada utilizando a genipina como agente de entrecruzamento para substituir o glutaraldeído, dada sua toxicidade. Tanto o suporte como a enzima imobilizada obtidos foram caracterizados e aplicados na hidrólise da lactose e na síntese de GOS. Por fim, investigou-se a estabilidade térmica da ß-galactosidase de Aspergillus oryzae imobilizada em macropartículas de quitosana em presença de lactose e GOS, a fim de simular as condições operacionais de obtenção deste prebiótico. Apesar das macro e nanopartículas de quitosana terem apresentado algumas diferenças entre si (área superficial, capacidade de carga, estabilidade térmica e retenção de atividade da enzima), ambos biocatalisadores puderam ser reutilizados por 50 bateladas de hidrólise. A hidrólise da lactose permaneceu estável ao longo de mais de 15 dias de operação, resultando em 90 % de conversão de lactose, a 37 ºC. Nesta mesma temperatura, a produtividade máxima de GOS foi de 484,5 g L-1 h-1. A estabilidade térmica da enzima foi melhorada em presença de lactose, glicose e galactose, o que sugere que sistemas de operação contínua podem contribuir na estabilização térmica da enzima. A imobilização da enzima de A. oryzae em macropartículas de quitosana entrecruzadas com genipina também foi bem sucedida, rendendo biocatalisadoresoperacionalmente estáveis, com hidrólise da lactose efetiva e estável durante 25 bateladas de reuso da enzima imobilizada. O parâmetro que mais teve influência na síntese de GOS foi a concentração de lactose, sendo que a concentração máxima de GOS obtida foi de 146 g L-1, utilizando uma solução de lactose 500 g L-1. A melhoria na estabilidade térmica da ß-galactosidase de A. oryzae imobilizada em macropartículas de quitosana foi bastante acentuada em presença de GOS, o que sugere que os processos de síntese deste composto podem ser otimizados em relação à temperatura, já que altas temperaturas facilitam o processo de dissolução da lactose e evitam a contaminação microbiana.Abstract : The ß-galactosidase (E.C 3.2.1.23) is one of the most used enzymes in the food industry, being mainly applied in lactose hydrolysis and galactooligosaccharides (GOS) synthesis. The immobilization of ß-galactosidase and others enzymes is an effective way to allow the reuse and to improve the thermal stability of the biocatalyst. Immobilization can be carried out on chitosan based supports, since they are safe and presents functional groups to direct enzyme immobilization or for modification with others functional groups. Then, the objective of this work was to study the lactose hydrolysis and GOS synthesis by using the enzyme ß-galactosidase immobilized on chitosan based supports. Firstly, chitosan macro and nanoparticles were obtained, characterized and used for immobilization of the ß-galactosidase from Kluyveromyces lactis. The enzyme load, the thermal stability and the operational stability were evaluated for each support. Subsequently, chitosan macroparticles were applied in a packed-bed reactor in order to evaluate the lactose hydrolysis and GOS synthesis in a continuous system. The immobilization of Aspergillus oryzae ß-galactosidase on chitosan macroparticles was carried out using genipin as crosslinking agent in order to replace glutaraldehyde, given its toxicity. The support and the immobilized enzyme obtained were characterized and applied in the lactose hydrolysis and in the GOS synthesis. Lastly, the thermal stability of A. oryzae ß-galactosidase immobilized on chitosan macroparticles was investigated in the presence of lactose and GOS, in order to simulate operational conditions for obtaining this prebiotic compound. Although chitosan macro and nanoparticles having shown some differences (surface area, load capacity, thermal stability and activity retention), both biocatalysts were reused for 50 batches of hydrolysis. The lactose hydrolysis remained stable during more than 15 days of continuous operation, yielding 90 % of lactose conversion, at 37 ºC. In the same temperature, maximum GOS productivity was 484.5 g L-1 h-1. The enzyme thermal stability was improved in the presence of lactose, glucose and galactose, this suggests that systems of continuous operation could contribute for the thermal stability of the enzyme. The immobilization of A. oryzae ß-galactosidase immobilized on chitosan macroparticles cross-linked with genipin was also satisfactory, with stable and effective lactose hydrolysis during 25 batches of reuse. The parameter that most influenced GOS synthesis was the initial lactose concentration, being 146 g L-1 the maximum GOS concentration achieved when 500 g L-1 lactose buffered solution was used. Theimprovement of A. oryzae ß-galactosidase thermal stability was substantial in the presence of GOS, suggesting that the synthesis of this compound can be optimized related to the temperature, once higher temperatures facilitates the process of lactose dissolution and avoid microbial contamination

Secagem da polpa de butiá pelo método de camada de espuma e caracterização do pó obtido

The objective of this work was to develop a drying process using the foam-layer method to obtain the powder from butiá (Butia spp.) pulp, as well as to characterize this powder according to its yield and physicochemical and technological characteristics. The foam was optimized for density and stability by varying whipping times and albumin and xanthan gum concentrations. Foam drying was optimized for vitamin C retention and yield using different foam thicknesses and drying temperatures. The optimized foam showed a density of 0.25 g cm-3 and a high stability, being suitable for subsequent drying. The lowest foam thickness (0.50 cm) and the highest drying temperature (80°C) resulted in the highest retention of vitamin C, whereas the increase in drying temperature improved yield. The butiá pulp powder obtained under the optimized condition presented an acid pH of 3.25, a low humidity of 7.97%, a water activity of 0.206, a water retention capacity of 4.90 g H2O per gram of powder, a solubility of 74.40%, a soluble solids content of 61°Brix, and a predominantly yellow color. The foam-layer drying method can be used to obtain butiá pulp powder.O objetivo deste trabalho foi desenvolver um processo de secagem, com o método de camada de espuma, para obter o pó da polpa de butiá (Butia spp.), bem como caracterizar esse pó de acordo sua produtividade e características físico-químicas e tecnológicas. A espuma foi otimizada quanto à sua densidade e estabilidade, tendo-se variado os tempos de batimento e as concentrações de albumina e goma xantana. Já a secagem da espuma foi otimizada em relação à retenção de vitamina C e à produtividade, com uso de diferentes espessuras da camada de espuma e temperaturas de secagem. A espuma otimizada apresentou densidade de 0,25 g cm-3 e alta estabilidade, sendo adequada para posterior secagem. A menor espessura de espuma (0,50 cm) e a maior temperatura de secagem (80°C) resultaram na maior retenção de vitamina C, enquanto o aumento da temperatura de secagem melhorou a produtividade. O pó de polpa de butiá obtido na condição otimizada apresentou pH ácido de 3,25, baixa umidade de 7,97%, atividade de água de 0,206, capacidade de retenção de água de 4,90 g de H2O por grama de pó, solubilidade de 74,40%, teor de sólidos solúveis de 61°Brix e cor predominantemente com tonalidade amarela. O método de secagem por camada de espuma pode ser utilizado para obter o pó de polpa de butiá

Pré-tratamentos enzimáticos para melhorar o processo de secagem de beterraba

The objective of this work was to evaluate the use of cellulase and pectinase as pretreatments for the drying of beetroot (Beta vulgaris). The experiment consisted of slices of beetroots subjected to four different treatments before the drying procedure, as follows: no wet pretreatment; wet pretreatment without enzymes; pectinase solution pretreatment; and cellulase solution pretreatment. Treatments were compared for drying rates, color change, content of betalains, and plant tissue structure. A modified Page model was used to describe the drying process. The enzymatic pretreatments did not improve the drying kinetics, although they changed the plant tissue structure. A negative influence on the drying was observed when pectinase was used; however, no effect was observed when cellulase was used. Slices treated with cellulase remained unchanged for color. Slices treated with pectinase showed significant changes of color, in comparison with the control treatments. The enzymatic pretreatments studied did not change the betalain concentrations and showed similar drying performance in the comparison with control treatments. Cellulase pretreatment is promising because it does not change the beetroot color or the betalain concentration.O objetivo deste trabalho foi avaliar o uso de celulase e pectinase como pré-tratamentos para a secagem de beterraba (Beta vulgaris). O experimento consistiu de fatias de beterraba submetidas a quatro diferentes tratamentos, antes do procedimento de secagem, conforme a seguir: pré-tratamento sem água; pré-tratamento com água, sem enzimas; pré-tratamento com solução de pectinase; e pré-tratamento com solução de celulase. Os tratamentos foram comparados quanto às taxas de secagem, mudança de cor, teor de betalaínas e estrutura do tecido vegetal. Um modelo Page modificado foi usado para descrever o processo de secagem. Os pré-tratamentos enzimáticos não melhoraram a cinética de secagem, embora tenham alterado a estrutura do tecido vegetal. Observou-se influência negativa sobre a secagem, quando a pectinase foi usada; no entanto, nenhum efeito foi observado quando a celulose foi usada. As fatias tratadas com celulase permaneceram inalteradas em relação à cor. As fatias tratadas com pectinase apresentaram alterações significativas de cor, em comparação aos tratamentos-controle. Os pré-tratamentos enzimáticos estudados não alteraram as concentrações de betalaínas e apresentaram desempenho de secagem similar aos dos tratamentos-controle. O pré-tratamento com celulase é promissor, pois não altera a cor da beterraba nem a concentração de betalaína

Development of a biocomposite based on alginate/gelatin crosslinked with genipin for β-galactosidase immobilization: Performance and characteristics

In this work, we studied the development of a biocomposite formulated with alginate and gelatin, crosslinked with genipin for application as support for β-galactosidase immobilization. Also, the biocomposites with the immobilized enzyme were characterized by thermal analyses and SAXS (size, density, and interconnectivity of alginate rods) for a detailed analysis of the microstructure, as well as the thermal and operational stabilities of the enzyme. The structural modifications of the biocomposite determined by SAXS demonstrate that the addition of both genipin and enzyme produced a significant reduction in size and density of the Ca(II)-alginate rods. Immobilized β-galactosidase could be stored for 175 days under refrigeration maintaining 80% of its initial activity. Moreover, 90% of its relative activity was kept after 11 reuses in a batch process of lactose hydrolysis. Thus, the biocomposite proved to be effective as support for enzyme immobilization.Fil: Hackenhaar, Camila Regina. Universidade Federal do Rio Grande do Sul; BrasilFil: Flores Rosa, Carolina. Universidade Federal do Rio Grande do Sul; BrasilFil: Esparza Flores, Elí Emanuel. Universidade Federal do Rio Grande do Sul; BrasilFil: Santagapita, Patricio Roman. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Centro de Investigaciones en Hidratos de Carbono. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Centro de Investigaciones en Hidratos de Carbono; ArgentinaFil: Poletto Klein, Manuela. Universidade Federal de Ciencias Da Saúde de Porto Alegre; BrasilFil: Hertz, Plinho Francisco. Universidade Federal do Rio Grande do Sul; Brasi

Aplicação de centeio, aveia e farelo de trigo no enriquecimento de bolos do tipo "muffin"

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Enzymatic pretreatment for the enhancement of beetroot drying process

Abstract The objective of this work was to evaluate the use of cellulase and pectinase as pretreatments for the drying of beetroot (Beta vulgaris). The experiment consisted of slices of beetroots subjected to four different treatments before the drying procedure, as follows: no wet pretreatment; wet pretreatment without enzymes; pectinase solution pretreatment; and cellulase solution pretreatment. Treatments were compared for drying rates, color change, content of betalains, and plant tissue structure. A modified Page model was used to describe the drying process. The enzymatic pretreatments did not improve the drying kinetics, although they changed the plant tissue structure. A negative influence on the drying was observed when pectinase was used; however, no effect was observed when cellulase was used. Slices treated with cellulase remained unchanged for color. Slices treated with pectinase showed significant changes of color, in comparison with the control treatments. The enzymatic pretreatments studied did not change the betalain concentrations and showed similar drying performance in the comparison with control treatments. Cellulase pretreatment is promising because it does not change the beetroot color or the betalain concentration

Imobilization of β-galactosidase to obtain dairy products with low teor of lactose

A β-galactosidase (E.C 3.2.1.23) é uma das enzimas mais empregadas na indústria de alimentos sendo utilizada na hidrólise da lactose. Neste trabalho foram utilizadas duas metodologias para imobilização desta enzima. Na primeira delas foi empregado como suporte um material híbrido à base de sílica que possui um grupo orgânico catiônico covalentemente ligado. A adsorção da enzima a este material apresentou eficiência que variou de 74 a 53% com o aumento da quantidade de enzima aplicada ao suporte. A baixa estabilidade térmica da enzima imobilizada obtida e as prováveis fracas interações envolvidas na sua adsorção a este suporte podem explicar o decréscimo de atividade observada durante as sucessivas bateladas de hidrólise da lactose. Na primeira batelada o grau de hidrólise foi de 90,9% e no final da última batelada (4ª), a enzima foi capaz de converter apenas 13% do substrato. A segunda metodologia utilizada foi imobilização covalente da enzima em um filme de celulose/líquido iônico modificado com uma poliamina e ativado com glutaraldeído. A presença da poliamina foi confirmada por análises de infravermelho. Após a imobilização, a enzima reteve 60% de sua atividade inicial. Bons resultados de hidrólise da lactose em batelada foram obtidos tanto a 7ºC como a 35ºC e foi possível reutilizar a enzima imobilizada por 16 ciclos consecutivos, a 7ºC, sem mudanças significativas na atividade enzimática. O valor de Km para a enzima imobilizada no material híbrido à base de sílica foi de 9,17 mM e para a enzima imobilizada nos filmes de celulose foi de 11,22 mM, ambos apresentaram um acréscimo quando comparados ao Km enzima livre (1,25 mM), devido à dificuldade de acesso do substrato ao sítio ativo da enzima. Não houve mudança no pH e temperatura ótimos da enzima imobilizada em relação à enzima livre em nenhum dos métodos testados.β-galactosidase (E.C 3.2.1.23) is the most widely used enzymes in the food industry and its employed in the lactose hydrolysis process. In this study, two methodologies were used to test their immobilization. In the first, the enzyme was immobilized by adsorption in one silica based hybrid material that contains a cationic organic group covalently linked. The efficiency of immobilization showed a decrease of 74 to 53% by increasing the protein load applied to the support. The low thermo stability of the immobilized enzyme and the probable weak interactions involved in their adsorption, could explain the decrease in enzyme activity observed in the successive batch hydrolysis of lactose. In the first run, the degree of lactose hydrolysis was 90.9% and, at the end of the last run (4th), the enzyme was able to convert only 13% of the substrate. The second methodology used was the covalent immobilization of the enzyme on a cellulose/ionic liquid film, modified with a polyamine and activated using glutaraldehyde. The presence of a polyamine was confirmed by infrared analysis. After immobilization, the enzyme retained 60% of its initial activity. Highly efficient lactose conversion was achieved in a batch process at 7ºC and 35ºC and was possible to reuse the immobilized enzyme in 16 repeated cycles, at 7ºC, without any drastic decrease in enzyme activity. Km value for the immobilized enzyme in silica based hybrid material was 9.17 mM and for the enzyme immobilized in the film of cellulose/ionic liquid was 11.22 mM, both showing an increase compared with the Km value for free enzyme (1.25 mM), due to the difficulty of access of the substrate to the active sites of the enzyme. The immobilized enzyme did not show any changes in the optimal pH and temperature when compared to the free enzyme in both methods tested

OBTENÇÃO DE GALACTOOLIGOSSACARÍDEOS UTILIZANDO β-GALACTOSIDASE IMOBILIZADA

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OBTENÇÃO DE GALACTOOLIGOSSACARÍDEOS UTILIZANDO β-GALACTOSIDASE IMOBILIZADA

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Desenvolvimento de um biorreator com B-galactosidase imobilizada para a produção de leite com baixo teor de lactose

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