Vitamin C, cancer and selective citotoxicity

A vitamina C é um nutriente essencial ao metabolismo das células vivas que existe sob duas formas: a forma reduzida (ácido ascórbico - AA) e a forma oxidada (ácido dehidroascórbico – DHA). A vitamina C é um nutriente cujos benefícios são desde há muito tempo conhecidos e amplamente divulgados, sendo que a sua maioria se devem à acção antioxidante desta vitamina. Como antioxidante, o principal papel da vitamina C é neutralizar os radicais livres doando-lhes os seus electrões, reflectindo a sua capacidade redutora e a habilidade para diminuir o stresse oxidativo. No entanto, alguns estudos controversos sugerem que este nutriente possa ter um papel preventivo e terapêutico na doença oncológica devido à sua eventual actividade pró-oxidante, promovendo a formação de espécies reactivas de oxigénio que podem induzir a morte celular nas células cancerígenas. Este factor, aliado à diminuição das enzimas antioxidantes e ao aumento de metais de transição descompartimentalizados nas células tumorais poderá resultar na citotoxicidade selectiva da vitamina C e na consequente revelação do seu potencial terapêutico. O objectivo deste trabalho é estudar o metabolismo e os mecanismos de acção da forma reduzida da vitamina C e mostrar o seu efeito citotóxico em duas linhas celulares tumorais: adenocarcinoma colorectal (WiDr) e melanoma melanocítico (A-375). Para tal, usaram-se técnicas de imagiologia nuclear e de biologia celular e molecular. Primeiramente, efectuou-se a marcação da forma reduzida da vitamina C com tecnécio-99m, de forma a obter um complexo radioactivo (99mTc-AA) passível de ser usado em imagiologia nuclear. Posteriormente, nos estudos in vitro, procedeu-se à realização de estudos de captação de 99mTc-AA e de pertecnetato de sódio nas duas linhas celulares estudadas, assim como à avaliação da citotoxicidade da vitamina através da avaliação da proliferação celular por espectrofotometria, ensaios clonogénicos e citometria de fluxo. Foram também feitos estudos in vivo com ratinhos Balb/c e Balb/c nu/nu com o intuito de comprovar os resultados obtidos no controlo de qualidade do 99mTc-AA e obter informação sobre a biodistribuição e vias de excreção e metabolização da formulação produzida. Por último, os ratinhos com xenotransplantes foram submetidos a uma terapia com AA e os tumores excisados foram analisados por citometria de fluxo. Os resultados obtidos sugerem que a forma reduzida da vitamina C induz um efeito anti-proliferativo e/ou citotóxico nas células em estudo, podendo eventualmente vir a constituir uma nova abordagem terapêutica no tratamento do cancro colorectal.Vitamin C is an essential nutrient to the metabolism of living cells which exist in two forms: the reduced form (ascorbic acid - AA) and oxidized form (dehydroascorbic acid - DHA). Vitamin C is a nutrient whose benefits are long known and widely publicized, being most of them related to the antioxidant action of this vitamin. As an antioxidant, the main role of vitamin C is neutralize free radicals by donating their electrons to them, reflecting their reduction capacity and the ability to reduce oxidative stress. However, some controversial studies suggest that this nutrient may have a preventive and therapeutic role in cancer disease due to their possible pro-oxidant activity, promoting the formation of reactive oxygen species that can induce cell death in cancer cells. This factor, coupled with the decrease of antioxidant enzymes and increased transition metal decompartmentalized in tumor cells may result in the selective cytotoxicity of vitamin C and the subsequent revelation of its therapeutic potential. The aim of this work is to study the metabolism and mechanisms of action of the reduced form of vitamin C and show their cytotoxic effect in two tumor cell lines: colorectal adenocarcinoma (WiDr) and melanocytic melanoma (A-375). To this end, we used nuclear imaging and molecular and cell biology techniques. First, we marked the reduced form of vitamin C with technetium-99m, in order to obtain a radioactive complex (99mTc-AA) that can be used in nuclear imaging. Subsequently, in in vitro studies, we performed the studies of uptake of 99mTc-AA and sodium pertechnetate in both cell lines studied, as well as evaluated the cytotoxicity of vitamin through the evaluation of cell proliferation by spectrophotometry, clonogenic assays and flow cytometry. Also had been made in vivo studies with Balb/c and Balb/c nu/nu mices in order to verify the results obtained in the quality control of 99mTc-AA and obtain information about the biodistribution and pathways of excretion and metabolism of the formulation produced. Finally, mice with xenografts were subjected to treatment with AA and excised tumors were analyzed by flow cytometry. The results suggest that the reduced form of vitamin C induces an anti-proliferative and/or cytotoxic effect in cells under study and may eventually be a new therapeutic approach in the treatment of colorectal cancer

Membrana amniótica: uma opção terapêutica para o cancro?

As propriedades anti-cancerígenas da membrana amniótica humana têm sido investigadas ao longo da última década. Estudos in vitro e in vivo revelaram que as células derivadas da membrana amniótica e meio por ela condicionado poderão vir a ser utilizados na terapia do cancro. O carcinoma hepatocelular representa atualmente uma importante causa de morte em todo o mundo. O transplante hepático e a ressecção cirúrgica por hepatectomia parcial são as únicas opções curativas atualmente disponíveis para o carcinoma hepatocelular em estadio inicial. Devido à assintomatologia da doença, o carcinoma hepatocelular é normalmente diagnosticado numa fase avançada não existindo, para tal, terapêuticas curativas adequadas. Neste caso, a quimioterapia e a radioterapia são frequentemente prescritas com o objetivo de aliviar os sintomas associados à normal progressão da doença. Assim sendo, é urgente descobrir novos agentes terapêuticos que se revelem eficazes contra o carcinoma hepatocelular. Até agora, o efeito da membrana amniótica enquanto tecido não foi investigado na doença oncológica. Por este motivo, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de extratos das membranas amnióticas humanas (hAMPE, do inglês human amniotic membrane protein extracts) no cancro humano, particularmente no carcinoma hepatocelular, recorrendo para tal a diversos modelos in vitro e in vivo, bem como a inúmeras técnicas de biologia celular e molecular. Os hAMPE foram capazes de inibir a atividade metabólica de diversas linhas celulares de cancro humano, entre as quais o carcinoma hepatocelular. Estudos pormenorizados revelam que os hAMPE são capazes de inibir a atividade metabólica, o conteúdo proteico e o conteúdo de ácido desoxirribonucleico (ADN) nas células de todas as linhas celulares de carcinoma hepatocelular estudadas, de forma dependente da dose e do tempo de exposição. O tratamento foi capaz de induzir a morte celular sendo, no entanto, a via de morte induzida dependente do perfil particular de cada linha celular. Desta forma, a via intrínseca da apoptose foi estimulada nas células da linha celular HuH7, tal como confirmado pelo aumento da expressão da razão BAX/BCl2, do citocromo C, da caspase 9 e da caspase 3. Por outro lado, a via extrínseca da apoptose foi induzida pelos hAMPE nas células HepG2 e Hep3B2.1-7. Nas células destas linhas celulares, foi registado um aumento da expressão da caspase 3 e da caspase 8. Nas células da linha celular HepG2 foi também observada necrose tumoral. Os hAMPE foram capazes de modificar o microambiente tumoral oxidativo de todas as linhas celulares de carcinoma hepatocelular estudadas, bem como o seu ciclo celular. Neste estudo verificou-se que os hAMPE atuaram de forma diferente a nível dos danos no ADN, da P21, da P53, da β-catenina, das proteínas de multirresistência (MDR, do inglês multidrug resistance) e dos transportadores de glicose (GLUT, do inglês glucose transporters) nas linhas celulares de carcinoma hepatocelular. Os hAMPE parecem surtir um efeito potenciador do 5-Fluouracilo (5-FU), da doxorrubicina, da cisplatina e do sorafenib, apesar da resposta obtida não ser homogénea entre as linhas celulares consideradas. Os resultados in vivo confirmaram, mais uma vez, que o sucesso da terapia com os hAMPE depende do perfil de cada linha celular. Os hAMPE apresentaram citotoxicidade seletiva, uma vez que não foram capazes de inibir a atividade metabólica, o conteúdo proteico e o conteúdo de ADN das células de uma linha celular não tumorigénica. Os resultados obtidos contribuíram para o estudo da terapia anti-cancerígena com recursos às membranas fetais, abrindo novas oportunidades no que à terapia do carcinoma hepatocelular diz respeito. Os nossos resultados sugerem também que as características genéticas e biológicas das linhas celulares são responsáveis pela resposta celular à terapia, tornando claro que as terapias anti-cancerígenas devem ser preferencialmente personalizadas.The anticancer properties of the human amniotic membrane has been investigated over the last decade. In vitro and in vivo studies showed that the amniotic membrane derived cells and their conditioned medium may play an important role in cancer therapy. Currently, hepatocellular carcinoma represents a worldwide major cause of death. Liver transplantation and surgical resection by partial hepatectomy are the only curative options available for early stage hepatocellular carcinoma. Due to the lack of symptoms, hepatocellular carcinoma is usually diagnosed at advanced stage. There are no curative therapies for advanced stage hepatocellular carcinoma. In this case, chemotherapy and radiotherapy are often prescribed in order to relieve the symptoms associated with the normal progression of the disease. For all this reasons, it is urgent to discover new and effective therapeutic agents against hepatocellular carcinoma. Considering that the effect of amniotic membrane as a tissue has not been investigated so far in cancer disease, the aim of this study was to evaluate the effect of human amniotic membrane protein extracts (hAMPE) in human cancer, particularly in hepatocellular carcinoma, using several in vitro and in vivo models, as well as different cellular and molecular biology techniques. hAMPE were able to inhibit the metabolic activity of several human cancer cell lines, including hepatocellular carcinoma. Detailed studies showed that hAMPE were able to inhibit the metabolic activity, protein and deoxyribonucleic acid (DNA) content in all hepatocellular carcinoma cell lines in a dose and time dependent manner. The treatment was able to induce cell death, but the induced death pathway was dependent on the particular profile of each cell line. Thus, the intrinsic apoptosis pathway was stimulated in the cells of the HuH7 cell line, as demonstrated by the increased expression of BAX/BCL2 ratio, cytochrome C, caspase 9 and caspase 3. On the other hand, the extrinsic apoptosis pathway was induced by hAMPE in the Hep3B2.1-7 and HepG2 cells. In these cell lines, there was an increase in the expression of caspase 3 and caspase 8. Regarding HepG2 cell line, tumour necrosis was also observed. The hAMPE were able to modify the oxidative tumour microenvironment in all hepatocellular carcinoma cell lines, as well as their cell cycle. In this study, it was found that hAMPE act differently in the DNA damage, P21, P53, β-catenin, multidrug resistance proteins (MDR) and glucose transporters (GLUT) of all hepatocellular carcinoma cell lines. The hAMPE seems to potentiate the effect of 5-fluorouracil (5-FU), doxorubicin, cisplatin and sorafenib, although the response obtained is not homogeneous across all the cell lines. The in vivo results also suggest that the success of hAMPE therapy depends of each cell line profile. hAMPE presents selective cytotoxicity, since were not able to inhibit the metabolic activity, protein and DNA content of a non-tumorigenic cell line. In conclusion, the results obtained in this study contribute to the anti-cancer therapy study with resource to fetal membranes, opening up new opportunities regarding the hepatocellular carcinoma therapy. In addition, the results also suggest that the genetic and biological characteristics of the cell lines are responsible for the cellular response to therapy, making it clear that the anti-cancer therapies should preferably be personalized.Fundo para a Investigação em Saúde, financiado pelo Infarmed; pelo Banco Santander Totta, no âmbito dos projetos de investigação premiados pelo Gabinete de Apoio à Investigação da Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra; pelo Centro de Investigação em Meio-Ambiente, Genética e Oncobiologia da Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra

Beyond the limits of oxygen: effects of hypoxia in a hormone-independent prostate cancer cell line

Prostate cancer (PCa) has a high incidence worldwide. One of the major causes of PCa resistance is intratumoral hypoxia. In solid tumors, hypoxia is strongly associated with malignant progression and resistance to therapy, which is an indicator of poor prognosis. The antiproliferative effect and induced death caused by doxorubicin, epirubicin, cisplatin, and flutamide in a hormone-independent PCa cell line will be evaluated. The hypoxia effect on drug resistance to these drugs, as well as cell proliferation and migration, will be also analyzed. All drugs induced an antiproliferative effect and also cell death in the cell line under study. Hypoxia made the cells more resistant to all drugs. Moreover, our results reveal that long time cell exposure to hypoxia decreases cellular proliferation and migration. Hypoxia can influence cellular resistance, proliferation, and migration. This study shows that hypoxia may be a key factor in the regulation of PCa.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Effect of amniotic membrane proteins in human cancer cell lines: an exploratory study

Human amniotic membrane (hAM) has recently drawn attention as an upcoming anti-cancer therapy. Regarding the strategies which have already investigated, little is known about hAM protein extracts (hAMPE) effect on cancer. So, this work aims to study the effect of hAMPE in metabolic activity of several human cancer cell lines. hAMPE were mechanically obtained, thus avoiding the effect of detergents and other reagents commonly used in protein extraction under the cell lines studied. After quantification of proteins in hAMPE, their effect on the metabolic activity of 21 human cancer cell lines was assessed by 3-(4,5-dimethylthia-zolyl-2)2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. Our results indicate that there is an inhibition of metabolic activity until 25 and 50% in two and seven cell lines, respectively. Five cell lines proved to be very sensitive to hAMPE, being its metabolic activity more than 50% inhibited. Our results show that hAMPE can inhibit the metabolic activity of some human cancer cell lines. However, research about this cell line-dependent response to hAMPE becomes indispensable.info:eu-repo/semantics/publishedVersio