バチルス・チューリンゲンシスにおける蚊の幼虫に対する殺虫性結晶タンパク質の発現増強に関する研究

九州工業大学博士学位論文 学位記番号：生工博甲第432号 学位授与年月日：令和4年3月25日1: Introduction|2: Enhanced insecticidal activity of Bacillus thuringiensis using a late embryogenesis abundant peptide co-expression system|3: Lactose as a time-dependent promising inducer in response to the efficient expression of insecticidal crystal protein by late embryogenesis abundant peptide co-expression system in Bacillus thuringiensis|4: General Conclusion九州工業大学令和3年

A microsystem for on-chip droplet storage and processing

Die Tropfen-Mikrofluidik ist ein nützliches Verfahren, mit dem biologische und chemische Experimente mit hoher Geschwindigkeit und verbesserter Effizienz durchgeführt werden können. Viele Anwendungen, wie die biologische Zellkultivierung sowie die chemische Analyse und das Screening erfordern die Positionierung und die Handhabung der Tröpfchen in dem Chip. Das Hauptziel dieser Forschungsarbeit war es, einen Mikrofluidik-Chip zu entwerfen, der Tröpfchen auf dem Chip generieren und speichern kann, um weitere Untersuchungen zu ermöglichen und potentielle Applikationen zu erforschen. Zu diesem Zweck wurden mehrere Materialien ausgewählt und untersucht. Letztendlich wurde ein Parylene AF4-beschichteter Polydimethylsiloxan (PDMS)-Chip hergestellt, der diese Anforderungen erfüllt. Die Hauptanwendungen von On-Chip-Speichertröpfchen stehen im direkten Zusammenhang mit der Zellspeicherung und der Zellkultivierung. Diese Anwendungen erfordern einen Mikrochip, der aus einem biokompatiblen Material, wie PDMS oder Parylene hergestellt ist. Um das On-Chip-Speichersystem zu bewerten, wurden Tröpfchen, die biologische Zellen enthielten, erzeugt. Diese verblieben mehr als vier Tage in dem entwickelten Chip. Neben der On-Chip-Speicherung von wässrigen Tröpfchen wurden auch Agarosetröpfchen hergestellt und platziert. Agarose wird häufig als Träger für die Kultivierung menschlicher und tierischer Zellen verwendet. Eine Agaroselösung kann bei geringen Konzentrationen ein stabiles Gel bilden, welches frei von Verunreinigungen ist und nicht an den Zellen haftet. Die Elastizität der Mikroumgebung hat einen signifikanten Einfluss auf das Zellwachstum. Die Agarosetröpfchen ermöglichen die Einkapselung von Zellen, die dann in verschiedenen elastischen Umgebungen kultiviert werden können. In einer durchgeführten Primärstudie wurden Hefezellen in Agarose eingekapselt. Diese Untersuchungen dienten dem Nachweis, dass mechanische Eigenschaften der Umgebung das Zellverhalten beeinflussen können. Um chemische Reaktionen anzuregen und Zellkulturen in Mikrotröpfchen zu realisieren, müssen Mikrotröpfchen aus verschiedenen Flüssigkeitsproben zusammengeführt werden. Die Handhabung der erforderlichen Tröpfchen ist ein weiterer wichtiger Aspekt der tropfenbasierten Mikrofluidik. Es wurde ein Chip entworfen und hergestellt, der Tröpfchen mit frischen Nährstoffen produziert und die gespeicherten Tröpfchen zusammenführt, um deren Zellen mit Nährstoffen zu versorgen. Tröpfchen, die Escherichia coli und Enterococcus faecalis enthielten, wurden mehrere Stunden in dem Chip in AF4-beschichteten PDMS-Kanälen aufbewahrt. Dabei wurde ein bis zu 5 Stunden andauerndes Zellwachstum beobachtet. Da Säugetierzellen jedoch aufgrund des Mangels an Sauerstoff und Kohlendioxid nicht über einen längeren Zeitraum in einem AF4-beschichteten Kanal gelagert werden können, wurde ein Verfahren zur Zufuhr von Sauerstoff zu den in einem Mikrokanal gespeicherten Tröpfchen entwickelt. Nahe den durch fluoriertes Öl getrennten wässrigen Tröpfchen wurden Luftblasen in demselben Mikrofluidikkanal positioniert, um den Sauerstoffgehalt mittels Diffusion anzupassen. Die Überwachung des Sauerstoffgehaltes in den wässrigen Tröpfchen erfolgte mittels des Redoxindikators Methylenblau. Des Weiteren wurden Madin-Darby Canine Kidney (MDCK)-Zellen eingekapselt und in Gegenwart von Luftblasen den Tröpfchen hinzugefügt. In der vorliegenden Forschungsarbeit konnte die Anwendbarkeit von AF4-beschichteten PDMS-Chips für die Speicherung und Kultivierung von Zellen experimentell nachgewiesen werden. Die Herstellung aller Testvorrichtungen erfolgte unter Verwendung schneller und kostengünstiger Methoden

Isolation of Pasteurella multocida from chickens, preparation of formalin killed fowl cholera vaccine, and determination of efficacy in experimental chickens

Objectives: The objectives of this study were to isolate and identify Pasteurella multocida from fowl cholera (FC) suspected chicken, and to prepare and efficacy determination of formalin killed fowl cholera vaccine using the isolated P. multocida strain. Materials and methods: A total of five suspected dead chickens were collected from Brothers Poultry Farm located at Gazipur district, Bangladesh. The samples were processed and the P. multocida was isolated through conventional bacteriological techniques, were finally confirmed by polymerase chain reaction using P. multocida specific primers targeting cap gene. The P. multocida isolate was used to develop a formalin killed fowl cholera vaccine. The efficacy of the newly prepared vaccine was determined in Starcross-579 chickens (n=30) aging 15 weeks either by injecting 1 mL (group-A; n=10) or 0.5 mL (group-B; n=10) vaccine containing approximately 3.2x108 CFU/mL P. multocida organism; 10 birds were kept as unvaccinated control. The sera from the vaccinated and control birds were collected and were subjected for antibody titre determination by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Finally the vaccinated birds were challenged using virulent strains of P. multocida to confer the protection against FC. Results: P. multocida could be isolated from both the samples. The formalin killed vaccine prepared from the isolated bacteria was subjected for the determination of antibody titre in chicken, and found that the antibody titres in the birds of group A and group B were 4.513 and 4.07 respectively after primary vaccination, and 4.893 and 4.37 respectively after booster vaccination. Most of the vaccinated birds were found to be survived after challenging with virulent strain of P. multocida. Conclusion: It is concluded that the causal agent of FC (P. multocida) was successfully isolated from FC affected dead chickens. The prepared formalin killed fowl cholera vaccine induces protective immune response and conferred protection against challenge infection caused by the virulent strain of P. multocida. [J Adv Vet Anim Res 2016; 3(1.000): 45-50

Spike protein mutations and structural insights of pangolin lineage B.1.1.25 with implications for viral pathogenicity and ACE2 binding affinity

Abstract Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), the causative agent of COVID -19, is constantly evolving, requiring continuous genomic surveillance. In this study, we used whole-genome sequencing to investigate the genetic epidemiology of SARS-CoV-2 in Bangladesh, with particular emphasis on identifying dominant variants and associated mutations. We used high-throughput next-generation sequencing (NGS) to obtain DNA sequences from COVID-19 patient samples and compared these sequences to the Wuhan SARS-CoV-2 reference genome using the Global Initiative for Sharing All Influenza Data (GISAID). Our phylogenetic and mutational analyzes revealed that the majority (88%) of the samples belonged to the pangolin lineage B.1.1.25, whereas the remaining 11% were assigned to the parental lineage B.1.1. Two main mutations, D614G and P681R, were identified in the spike protein sequences of the samples. The D614G mutation, which is the most common, decreases S1 domain flexibility, whereas the P681R mutation may increase the severity of viral infections by increasing the binding affinity between the spike protein and the ACE2 receptor. We employed molecular modeling techniques, including protein modeling, molecular docking, and quantum mechanics/molecular mechanics (QM/MM) geometry optimization, to build and validate three-dimensional models of the S_D614G-ACE2 and S_P681R-ACE2 complexes from the predominant strains. The description of the binding mode and intermolecular contacts of the referenced systems suggests that the P681R mutation may be associated with increased viral pathogenicity in Bangladeshi patients due to enhanced electrostatic interactions between the mutant spike protein and the human ACE2 receptor, underscoring the importance of continuous genomic surveillance in the fight against COVID -19. Finally, the binding profile of the S_D614G-ACE2 and S_P681R-ACE2 complexes offer valuable insights to deeply understand the binding site characteristics that could help to develop antiviral therapeutics that inhibit protein–protein interactions between SARS-CoV-2 spike protein and human ACE2 receptor