Le virus de la maladie du sommeil des Salmonidés (mise au point d'un ADNc infectieux et obtention d'anticorps monoclonaux)

Le Virus de la Maladie du Sommeil (VMS) a été caractérisé au laboratoire comme étant le premier alphavirus aquatique appartenant donc à la famille des Togaviridae. Au cours de ce travail de thèse nous avons poursuivi 3 objectifs : (i) élaboration d'un ADNc infectieux, (ii) génération d'un éventail d'anticorps monoclonaux contre les protéines non structurales et structurales du VMS, et cartographie de certains de ces anticorps, (iii) développement de méthodes diagnostiques pour le VMS.(i) Le génome du VMS est un ARN positif de 12 kb environ, entièrement séquencé. Il a été converti en ADNc et cloné dans un vecteur d'expression eucaryote sous le contrôle de différentes séquences promotrices : soit SP6 (dérivée du phage SP6), soit T7 (dérivée du phage T7), soit du CMV (promoteur précoce du cytomégalovirus). En premier lieu, des minigénomes dans lesquels un gène rapporteur (luciférase, GFP) remplace la région codante pour les protéines structurales ont été construits. Leur expression a été testée et mise au point en transfectant à des cellules de poisson, soit l'ARN synthétisé in vitro à partir du promoteur SP6, soit l'ADN plasmidique porteur des promoteurs CMV ou T7. De cette façon, nous avons déterminé les conditions nécessaires à la réplication du génome viral et à sa détection. Le VMS ne peut être exprimé lorsqu'il est fusionné à la séquence promotrice qui le précède, ce qui constitue une autre particularité de cet alphavirus atypique. Dans le système d'expression CMV/T7, le remplacement du gène rapporteur par la région codant pour les protéines structurales du VMS conduit à la production de particules virales réplicatives identiques au virus sauvage lorsque l'ADNc est transfecté à des cellules de poisson.Sleeping Disease Virus (SDV) has been characterised in our laboratory as being the first aquatic alphavirus belonging to the Togaviridae family. During this work, we pursue three objectives : (i) elaboration of an infectious cDNA, (ii) generation of a panel of monoclonal antibodies directed against structural and non structural viral proteins, (iii) development of an RT-PCR diagnostic method.(i) The SDV genome is a positive single strand of RNA of approximately 12 kb which sequence is determined. It has been converted in a full lenght cDNA and cloned in an eukaryotic expression vector under the control of several different promoters : either the SP6 promoter (derived from SP6 phage), or the T7 promoter (derived from T7 phage), or the CMV promoter (early promoter of cytomegalovirus). First, replicons expressing a reporter gene (luciferase, GFP) instead of the structural genes have been constructed. Expression of these replicons has been tested through transfection of fish cells using either RNA transcribed from SP6 promoter, or plasmid DNA carrying CMV or T7 promoters. It was not possible to express SDV genome when it is directly fused to the promoter. In the CMV/T7 expression system, replacement of reporter gene by the structural genes allowed the recovery of infectious viral particles when cDNA was transfected into fish cells. The virulence of this recombinant virus has been studied in vivo on juvenile rainbow trouts. We show that this virus is greatly attenuated and induce a long lasting protection.Otherwise, this system has been tested for development of a gene vector : a second transcriptional unit coding to the GFP protein has been inserted either upstream, or downstream of the structural genes.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF