Enhanced oligomerization of full-length RAGE by synergy of the interaction of its domains.

The pattern recognition receptor RAGE (receptor for advanced glycation end-products) transmits proinflammatory signals in several inflammation-related pathological states, including vascular diseases, cancer, neurodegeneration and diabetes. Its oligomerization is believed to be important in signal transduction, but RAGE oligomeric structures and stoichiometries remain unclear. Different oligomerization modes have been proposed in studies involving different truncated versions of the extracellular parts of RAGE. Here, we provide basic characterization of the oligomerization patterns of full-length RAGE (including the transmembrane (TM) and cytosolic regions) and compare the results with oligomerization modes of its four truncated fragments. For this purpose, we used native mass spectrometry, analytical ultracentrifugation, and size-exclusion chromatography coupled with multi-angle light scattering. Our results confirm known oligomerization tendencies of separate domains and highlight the enhanced oligomerization properties of full-length RAGE. Mutational analyses within the GxxxG motif of the TM region show sensitivity of oligomeric distributions to the TM sequence. Using hydrogen-deuterium exchange, we mapped regions involved in TM-dependent RAGE oligomerization. Our data provide experimental evidence for the major role of the C2 and TM domains in oligomerization, underscoring synergy among different oligomerization contact regions along the RAGE sequence. These results also explain the variability of obtained oligomerization modes in RAGE fragments

Interaction interface in the C-terminal parts of centriole proteins Sas6 and Ana2

The centriole is a ninefold symmetrical structure found at the core of centrosomes and, as a basal body, at the base of cilia, whose conserved duplication is regulated by Plk4 kinase. Plk4 phosphorylates a single serine residue at the N-terminus of Ana2 to promote Ana2's loading to the site of procentriole formation. Four conserved serines in Ana2's STAN motif are then phosphorylated by Plk4, enabling Sas6 recruitment. Crystallographic data indicate that the coiled–coil domain of Ana2 forms a tetramer but the structure of full-length Ana2 has not been solved. Here, we have employed hydrogen–deuterium exchange coupled with mass spectrometry (HDX-MS) to uncover the conformational dynamics of Ana2, revealing the high flexibility of this protein with one rigid region. To determine the elusive nature of the interaction surfaces between Ana2 and Sas6, we have confirmed complex formation between the phosphomimetic form of Ana2 (Ana2-4D) and Sas6 in vitro and in vivo. Analysis of this complex by HDX-MS identifies short critical regions required for this interaction, which lie in the C-terminal parts of both proteins. Mutational studies confirmed the relevance of these regions for the Ana2–Sas6 interaction. The Sas6 site required for Ana2 binding is distinct from the site required for Sas6 to bind Gorab and Sas6 is able to bind both these protein partners simultaneously

Protein partners of the eEF1Bβ subunit of the translation elongation complex eEF1B in the nuclear fraction of human lung carcinoma cells

Aim. To identify novel protein partners of translation factor eEF1Bβ in nucleus of human lung carcinoma cells. Methods. Protein partners of eEF1Bβ in the nuclear fraction of A549 cells were identified by co-immunoprecipitation (co-IP) combined with liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Specific protein partners of eEF1Bβ were further selected by using the results of previously published global, quantitative and dynamic mapping of protein subcellu-lar localization with help of “Mapofthecell” program. Results. 104 high-scored proteins interact-ing with eEF1Bβ in the nuclear fraction of A549 cells have been identified by mass-spectrometry. Among these proteins, 9 partners of eEF1Bβ were confirmed by the co-fractionation approach. Functional analysis of the partners has divided them on the pro-oncogenic (lung-cancer related) and neutral/anti-oncogenic moieties. These two groups are estimated to be spatially separated in human cancer cells. Conclusions. The position of eEF1Bβ as a link between the oncogenic and neutral/tumor-suppressor moieties of its protein partners in nucleus of lung cancer cells is sug-gested. Deciphering of a possible role of the eEF1Bβ distribution between the pro-cancer or anti-cancer communities of its protein partners can be a subject of further research.Мета. Виявити нових білків-партнерів фактора трансляції eEF1Bβ в ядрі клітин карциноми легені. Методи. Білки-партнери eEF1Bβ, отримані з ядерного екстракту клітин А549 методом ко-імунопреципітації (co-IP), були ідентифіковані за допомогою высокоефективної рідинної хроматографії з тандемною мас-спектрометрією (LC-MS/MS). Подальше підтвердження білків-партнерів проводили із використанням опублікованих даних глобального, кількісного і динамічного картування субклітинної локалізації білків за допомогою програми Mapofthecell. Результати. 104 білки, які взаємодіють із eEF1Bβ в ядерній фракції клітин карциноми легені A549 були ідентифіковані мас-спектрометрією. Проміж цих білків, 9 партнерів eEF1Bβ були підтверджені даними із прецизійного субклітинного фракціонування. За допомогою функціонального аналізу ці білки-партнери можуть бути поділені на про-онкогенну і нейтральну/анти-онкогенну групи. Передбачено, що ці групи можуть бути просторово розділені в ракових клітинах людини. Висновки. Запропоновано, що eEF1Bβ може бути проміжною ланкою між онкогенною і нейтральною/пухлиносупресорною групами партнерів цього білка в ядрі ракових клітин. Розшифрування можливої ролі залучення eEF1Bβ до про-ракової або анти-раковими спільнот білкових партнерів цього білку може бути предметом подальших дослiджень.Цель. Выявление новых белков-партнеров фактора трансляции eEF1Bβ в ядре клеток карциномы легкого. Методы. Белки-партнёры eEF1Bβ, полученные из ядерного экстракта клеток А549 методом ко-иммунопреципитации (co-IP), были идентифицированы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS). Дальнейшее подтверждение белков-партнеров проводили с использованием опубликованных ранее данных глобального, количественного и динамичного картирования субклеточной локализации белков с помощью программы «Mapofthecell». Результаты. Методом масс-спектрометрии было идентифицировано 104 белка, взаимодействующих с eEF1Bβ в ядре клеток A549. Из этих белков, 9 партнеров eEF1Bβ были подтверждены данными, полученными при подробном субклеточном фракционировании. С помощью функционального анализа эти белки-партнеры можно разделить на про-онкогенную і нейтральную/анти-онкогенную группы. Предсказано, что эти группы могут быть разделены в пространстве в раковых клетках человека. Выводы. Выдвинуто предположение, что eEF1Bβ может быть промежуточным звеном между онкогенной и нейтральной/опухоле-супрессорной группами его партнеров в ядре раковых клеток. Расшифровка возможной роли вовлечения eEF1Bβ в про-раковую или анти-раковую группы его белковых партнеров может быть предметом дальнейших исследований

Non-canonical interactions of the β subunit of the translation elongation complex eEF1B and analysis of their possible functional role

Aim. To predict protein networks which may comprise the β subunit of the translation elongation complex eEF1B in lung carcinoma cell line. Methods. The protein partners of eEF1Bβ from cytoplasmic extract of A549 cells were identified by co-immunoprecipitation (co-IP) combined with liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). The molecular interaction network for eEF1Bβ was predicted and visualized by a Cytoscape 3.2.0 program using an MCODE plugin. GO analysis of cellular distribution was performed by a STRAP Program. Results. 162 high-scored proteins interacting with eEF1Bβ in the cytoplasm of lung carcinoma cells A549 have been identified by mass-spectrometry. Possible functional networks involving these contacts were predicted bioinformatically. Conclusions. Four protein networks are identified as possible targets of eEF1Bβ in lung cancer cells. These groups are involved in the cell cycle regulation; DNA replication and repair; chromatin remodeling; chaperoning and signal transduction. The dataallow to narrow down further search for non-canonical cancer-related function of eEF1Bβ.Мета. Передбачити, до яких функціональних кластерів білків клітин карциноми легені А-549 може входити субодиниця β комплексу факторів елонгації трансляції eEF1B. Методи. Білки-партнери eEF1Bβ, отримані з цитоплазматичного екстракту клітин А549 методом ко-імунопреципітації (co-IP), були ідентифіковані за допомогою высокоефективної рідинної хроматографії з тандемною мас-спектрометрією (LC-MS/MS). Сітка молекулярних взаємодій eEF1Bβ була передбачена і побудована за допомогою програми Cytoscape 3.2.0 з використанням плагіна MCODE. Результати. Методом мас-спектрометрії було ідентифіковано 162 білка, що взаємодіють з eEF1Bβ в цитоплазмі клітин карциноми легені A549. Можливі функціональні сітки, що включають ці контакти, були передбачені біоінформатично. Висновки. Чотири білкові сітки були ідентифіковані як можливі мішені eEF1Bβ при раку. Ці групи білків залучені в регуляцію клітинного циклу; реплікацію та репарацію ДНК, ремоделювання хроматину; шаперонну функцію та сигнальну трансдукцію. Отриманні данні дозволяють звузити поле подальшого пошуку неканонічних, пов’язаних з раком функцій eEF1Bβ.Цель. Предсказать функциональные кластеры белков, в какие может быть вовлечена β субъединица комплекса факторов элонгации трансляции eEF1B в клетках карциномы легкого А549. Методы. Белки-партнёры eEF1Bβ, полученные из цитоплазматического экстракта клеток А549 методом ко-иммунопреципитации (co-IP), были идентифицированы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии и последующей тандемной масс-спектрометрии (LC-MS/MS). Сеть молекулярных взаимодействий eEF1Bβ была предсказана и построена с помощью программы Cytoscape 3.2.0 с использованием плагина MCODE. Результаты. Методом масс-спектрометрии было идентифицировано 162 белка, взаимодействующих с eEF1Bβ в цитоплазме клеток карциномы лёгкого A549. Возможные функциональные сети, включающие эти контакты, были предсказаны биоинфор-матически. Выводы. Четыре белковые сети были идентифицированы в качестве возможных мишеней eEF1Bβ при раке. Эти группы белков вовлечены в регуляцию клеточного цикла; репликацию и реперацию ДНК, ремоделирование хроматина; шаперонную функцию и сигнальную трансдукцию. Полученные данные позволяют сузить поле дальнейшего поиска неканонических, связанных с раком функций eEF1Bβ