Purificação de antígenos do lentivirus caprino por coluna de afinidade.

No processo de purificação das proteínas dos lentivírus para produção de antígenos (Ags) ocorrem perdas principalmente das glicoproteinas por serem relativamente instáveis. Optou-se pela utilização de cromatografia em coluna de afinidade na purificação de proteínas do lentivírus caprino (LVC). No preparo da coluna de afinidade utilizou-se soro de caprinos positivo ao teste de microimunodifusão em gel de ágar (MIDGA) e pool de lotes de soro reagente integrante do kit comercial. A IgG foi obtida por precipitação em sulfato de amônio. A coluna foi preparada com proteina A imobilizada em sefarose CL-4B. Foi purificado o antígeno lote 1 (AgL1) obtido por concentração do sobrenadante de subcultivos de células de membrana sinovial caprina infectadas com LVC. O antigeno comercial (Agkit), AgL1 e o antígeno purificado (AgL1CA) foram submetidos a eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), immunoblotting e ELISA indireto. Na eletroforese verificou-se no AgL1CA quatro proteínas de peso molecular (PM) aproximado: 8OkDa, 70kDa, 55kDa e 27kDa. No immunoblotting verificou-se que todos os Ags apresentaram uma banda de aproxitnadanente 27 kDa, sendo que, no AgL1CA ela foi mais intensa. No AgL1CA e AgL1 constatou-se outra banda de PM aproximado de 48 kDa, entretanto sendo bem mais forte no AgL1CA. No AgL1 observou-se, tanbém, uma banda com 70 kDa. Verificou-se, também, a presença da glicoproteina com PM variando de 140 a 145 kDa em todos os antígenos. Nos AgL1 e AgL1CA observou-se, ainda, uma banda de PM de 19kDa. Comparando as bandas observadas por SDS-PAGE com as do immunoblotting, pode-se verificar que nos AgKit e AgL1 somente a proteína p28 apareceu nitidamente. No ELISA indireto utilizando o AgL1CA observou-se que a diluição do soro de 1:200 e 200ng de antígeno apresentou uma diferença, entre as densidades ópticas do pool de soros positivos e negativos, de aproximadamente O,5 que viabiliza o desenvolvimento deste teste. Diante dos resultados verificou-se que o uso da cromatografia de afinidade é uma alternativa viável na obtenção de antígenos altamente purificados

DOT-BLOT para detecção de anticorpos contra lentivírus de pequenos ruminantes, em caprinos.

Resumo: A técnica de imunodifusão em gel de ágar (IDGA) é empregada mundialmente como método de triagem e monitoramento das fases iniciais de programas de controle das lentiviroses de pequenos ruminantes, mas apesar da boa especificidade, a IDGA pode apresentar resultados falso-negativos. Testes com maior sensibilidade devem ser utilizados quando ocorrer redução substancial da quantidade de animais soropositivos, testados por IDGA, e ainda, quando a taxa de soroconversão no rebanho, apesar de baixa, for mantida. Este trabalho teve como objetivo padronizar o teste Dot-Blot (DB) para a detecção de anticorpos, em caprinos, contra o Lentivírus Caprino (LVC), utilizando antígeno experimental preparado a partir do vírus total, e compará-lo com a IDGA e com ELISA indireto (ELISA-i). Na realização do (DB) a membrana de nitrocelulose (MN) foi disposta num aparelho de blot de 96 poços onde se colocou antígeno com uma concentração de 0,5mg de proteína/poço. Os sítios livres de ligação de proteínas foram bloqueados pela adição do tampão de bloqueio (caseína). Colocaram-se as tiras de MN em tubos de ensaio contendo soro teste diluído (1:100). Após, distribuiu-se o conjugado (peroxidase IgG coelho anti-cabra) diluído 1:500 em PBS-T e revelou-se a MN numa solução de DAB/4-Cloronapthtol. Num total de 327 amostras verificou-se que o ELISA-i detectou 209 caprinos positivos, o DB detectou 200, enquanto a IDGA detectou 144 animais. O DB mostrou concordância de 90,2% (p<0,01) com o Elisa-i. O DB é um teste mais viável que a IDGA e o ELISA-i para utilização no controle desta infecção, pois além de ser mais sensível que a IDGA, não necessita da indumentária tecnológica do ELISA-i, podendo ser utilizado em eventos (exposições, leilões, etc) ou até mesmo no campo.1 CD-ROM 002