TWO-PHASE DYNAMICS OF BONE MARROW MULTIPOTENT MESENCHYMAL STROMAL CELLS (MMSC) ACTION ON LIVER AT MODELING OF FIBROTIC HEPATITIS

Under the modeling of chronic fibrousing hepatitis in rats (n = 75) the dynamics of fibrolytic effect of bone mar- row MMSC was examined after one or two-time infusion of these cells at the early stage of liver fibrosis. By dynamic measuring of liver fibrotic area and the expression of activated stellate cell markers (desmin, α-SMA) and markers of cell apoptosis (caspase-3 and caspase-9) within 90 days two phases of the development of bone marrow MMSC fibrolytic effect were found. It is shown that the development of fibrolytic effect includes the primary phase of intensification of fibrosis, which is followed by the phase of enhanced fibrolytic process in the liver. It was determined that the two-phase dynamics of liver regeneration was more intensive after two-time infusion of bone marrow MMSC

О РОЛИ СИНУСОИДАЛЬНЫХ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ И КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА В ОБЕСПЕЧЕНИИ РЕГЕНЕРАТОРНОЙ СТРАТЕГИИ ЗДОРОВОЙ И ПОВРЕЖДЕННОЙ ПЕЧЕНИ

Sinusoidal cells play the key role at all kinds of liver regeneration (physiological, reparative, fibrogenetic), which vector depends on adaptative reserves of these cells (first of all Ito cells) stressful damaging factors affect. It was demonstrated that under reparative liver regeneration the recovery of hepatocytes pool originates not only from mitosis, but from regional stem cells – oval cells, Ito cells and from migrating bone marrow cells. Fibrogenetic liver regeneration occurs as a result of inhibiting stem cell function of Ito cells and bone marrow cells. Синусоидальные клетки при всех видах регенерации печени (физиологической, репаративной, фиброзирующей) играют ведущую роль, вектор которой зависит от резервов адаптации этих клеток, прежде всего КИ, к воздействию стрессорных повреждающих факторов. Показано, что при репаративной регенерации печени восполнение пула гепатоцитов происходит не только путем митотического деления гепатоцитов, но и путем их образования из регионарных стволовых клеток – овальных клеток, клеток Ито и мигрирующих клеток костного мозга. Фиброзирующая регенерация печени наступает в результате ингибирования стволовых функций клеток Ито и стволовых клеток костного мозга.

Коррекция хронической печеночной недостаточности в эксперименте путем имплантации клеточно-инженерных конструкций: морфофункциональные характеристики

Objective: to study the effectiveness of correcting the morphofunctional characteristics of the liver in an experimental model of chronic liver disease (CLD), using implanted cell-engineered constructs (CECs).Materials and methods. Experiments were carried out on male Wistar rats (n = 80) aged 6–8 months with an initial weight of 230–250 g. CLD was modeled by inoculating the rats with 60% CCl4 oil solution for 42 days based on a modified scheme. Microgel based on recombinant spidroin rS1/9 was used as a matrix for CECs fabrication. Allogeneic liver cells (LCs) and multipotent bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BM-MSCs) from a healthy donor were used as the cellular component of the CECs. The effectiveness of the corrective effect of the implanted CECs was assessed in an experimental CLD model (n = 60) in two groups of rats: Group 1 (control, n = 20, 1 mL of saline solution was injected into the damaged liver parenchyma) and Group 2 (experimental, n = 40, CECs containing allogenic LCs and BM-MSCs in a 5 : 1 ratio in a volume of 1 mL were implanted into the damaged liver parenchyma). For long-term monitoring of the CEC state, the CECs were labeled by additional inclusion in Cytodex-3. The effectiveness of the regulatory effect of CECs on regenerative processes in the liver was evaluated using biochemical, morphological and morphometric techniques, as well as by flow cytometry at 90 days after implantation.Results. In the control group, the mortality rate in CLD was 25%. There was no death in the experimental group with CLD after CEC implantation. The CECs were found to have a corrective effect on the biochemical and morphological parameters of the liver in CLD during 90 days of follow-up, with concomitant preservation of structural cellular homeostasis in the implanted CECs. Conclusion. Implantation of CECs in the liver facilitates effective correction of CLD by activating regenerative processes in the damaged liver, which is due to long-term preservation of structural cellular homeostasis in the CECs.Цель: на экспериментальной модели хронической печеночной недостаточности (ХПН) изучить эффективность коррекции морфофункциональных характеристик состояния печени с помощью имплантируемых в нее клеточно-инженерных конструкций (КИК).Материалы и методы. Опыты проведены на крысахсамцах породы Вистар (n = 80) в возрасте 6–8 месяцев с исходной массой 230–250 г. Моделирование ХПН осуществляли путем затравки крыс 60% масляным раствором CCl4 по модифицированной схеме в течение 42 суток. В качестве матрикса для изготовления КИК использовали микрогель на основе рекомбинантного спидроина rS1/9. Клеточным компонентом КИК служили аллогенные клетки печени (КП) и мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки костного мозга (ММСК КМ) здорового донора. Эффективность корригирующего воздействия имплантируемых КИК оценивали на экспериментальной модели ХПН (n = 60) в двух группах крыс: 1-я группа – контроль (n = 20), в паренхиму поврежденной печени вводили 1 мл физиологического раствора; 2-я группа – экспериментальная (n = 40), в паренхиму поврежденной печени имплантировали КИК, содержащие аллогенные КП и ММСК КМ в соотношении 5 : 1 в объеме 1 мл. Для осуществления длительного наблюдения за состоянием КИК их маркировали путем дополнительного включения в состав Цитодекса-3. Эффективность регуляторного воздействия КИК на восстановительные процессы в печени оценивали с помощью биохимических, морфологических и морфометрических методов, а также метода проточной цитофлуометрии на сроке 90 суток после имплантации.Результаты. В контрольной группе летальность при моделировании ХПН составила 25%. Летальность в экспериментальной группе с ХПН при имплантации КИК отсутствовала. Установлено корригирующее воздействие КИК на используемые биохимические и морфологические показатели состояния печени при ХПН в течение 90 суток наблюдения при сопутствующем сохранении структурного гомеостаза клеток в имплантируемых КИК.Заключение. Использование КИК, имплантируемых в печень, позволяет осуществлять эффективную коррекцию ХПН путем активации восстановительных процессов в поврежденной печени, которая обусловлена длительным сохранением структурного гомеостаза клеток, включенных в состав КИК

Интерлейкин IL-1β стимулирует ревитализацию хрящевого матрикса назальными хондроцитами человека in vitro

Revitalization of decellularized or devitalized matrix scaffolds in tracheal tissue engineering typically involves seeding the autologous recipient cells or allogeneic cells under long-term cultivation. Objective: to study the capability of human nasal chondrocytes for colonization of devitalized scaffolds based on native human tracheal cartilage, with proinflammatory stimulation (cytokine) by adding Interleukin-1-beta (IL-1β) to the culture medium. Materials and methods. Scaffolds for tracheal tissue engineering were obtained from native human tracheal cartilage through devitalization and laser etching. The scaffold was revitalized by seeding the human nasal chondrocytes. Histological examination was performed after staining with hematoxylin and safranin-O, with further microscopy using a Nikon Eclipse L200 light microscope. X-ray microtomography was performed on a Phoenix nanotom m apparatus. Electron microscopy was performed on a Nova NanoSEM 230 setup. Results. There was statistically significant increase in the intensity of colonization (p = 0.0008) with nasal chondrocytes and stimulation of their migration activity (p < 0.0001) in the presence of IL-1β compared with the control groups. Conclusion. Addition of proinflammatory cytokine IL-1β (1 μg/ml) to the culture medium enhances volumetric seeding of devitalized cartilage scaffold with human nasal chondrocytes, allowing to create highly revitalized materials for tracheal tissue engineering.Ревитализация децеллюляризированных или девитализированных матриксов для тканевой инженерии трахеи, как правило, предполагает заселение матрикса-носителя на основе донорской хрящевой ткани аутологичными клетками реципиента или аллогенными клетками в условиях длительного культивирования. Цель работы – изучить эффективность колонизации девитализированных матриксов на основе естественной хрящевой ткани трахеи человека назальными хондроцитами человека при добавлении к питательной среде провоспалительного цитокина Интерлейкин-1-бета (IL-1β). Материалы и методы. Матриксы-носители для тканевой инженерии трахеи получали на основе естественной хрящевой ткани трахеи человека методом девитализации и лазерного травления. Ревитализацию матриксов проводили путем заселения назальных хондроцитов человека. Гистологическое исследование проводили после окрашивания гематоксилином и сафранином-О с дальнейшей микроскопией на световом микроскопе Nikon Eclipse L200. Рентгеновская микротомография выполнялась на аппарате Phoenix nanotom m. Электронная микроскопия проводилась на установке Nova NanoSEM 230. Результаты. Выявлено статистически значимое увеличение интенсивности колонизации назальными хондроцитами (p = 0,0008) и стимулирование их миграционной активности (p < 0,0001) в присутствии IL-1β по сравнению с контрольными группами. Выводы. Добавление провоспалительного цитокина IL-1β в концентрации 1 мкг/мл к питательной среде способствует объемному заселению девитализированного хрящевого матрикса назальными хондроцитами человека, позволяя создавать высокоревитализированные материалы для тканевой инженерии трахеи

ДВУХФАЗНАЯ ДИНАМИКА ВОЗДЕЙСТВИЯ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК (ММСК) КОСТНОГО МОЗГА НА ПЕЧЕНЬ ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ФИБРОЗИРУЮЩЕГО ГЕПАТИТА

Under the modeling of chronic fibrousing hepatitis in rats (n = 75) the dynamics of fibrolytic effect of bone mar- row MMSC was examined after one or two-time infusion of these cells at the early stage of liver fibrosis. By dynamic measuring of liver fibrotic area and the expression of activated stellate cell markers (desmin, α-SMA) and markers of cell apoptosis (caspase-3 and caspase-9) within 90 days two phases of the development of bone marrow MMSC fibrolytic effect were found. It is shown that the development of fibrolytic effect includes the primary phase of intensification of fibrosis, which is followed by the phase of enhanced fibrolytic process in the liver. It was determined that the two-phase dynamics of liver regeneration was more intensive after two-time infusion of bone marrow MMSC. На модели хронического фиброзирующего гепатита у крыс (n = 75) изучена динамика развития фиброли- тического действия ММСК костного мозга (КМ) при однократном и двукратном применении этих клеток на раннем этапе фиброзирования печени. При динамическом морфометрическом изучении в течение 90 суток площади фиброзной ткани в печени, экспрессии маркеров активированных звездчатых клеток (десмин, α-ГМА) и маркеров клеточного апоп- тоза (каспаза-3, каспаза-9) установлены две фазы в развитии фибролитического действия ММСК КМ. Показано, что развитие фибролитического эффекта включает фазу первоначального усиления фиброза, которая сменяется фазой усиления фибролитических процессов в печени. Установлено, что двухфазная динамика наиболее выражена при двукратном применении ММСК КМ.

Extension of Maximal Lifespan and High Bone Marrow Chimerism After Nonmyeloablative Syngeneic Transplantation of Bone Marrow From Young to Old Mice

The goal of this work was to determine the effect of nonablative syngeneic transplantation of young bone marrow (BM) to laboratory animals (mice) of advanced age upon maximum duration of their lifespan. To do this, transplantation of 100 million nucleated cells from BM of young syngeneic donors to an old nonablated animal was performed at the time when half of the population had already died. As a result, the maximum lifespan (MLS) increased by 28 ± 5%, and the survival time from the beginning of the experiment increased 2.8 ± 0.3-fold. The chimerism of the BM 6 months after the transplantation was 28%

ТРАНСПЛАНТАЦИЯ КЛЕТОЧНО-ИНЖЕНЕРНЫХ КОНСТРУКЦИЙ В ПЕЧЕНЬ ОБЕСПЕЧИВАЕТ ДЛИТЕЛЬНУЮ ПОДДЕРЖКУ ПРОЦЕССОВ ВОССТАНОВИТЕЛЬНОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ В ПОВРЕЖДЕННОЙ ПЕЧЕНИ

Aim is to develop a method for a prolonged support of recovery processes in damaged liver. Materials and me- thods. It was carried out 3 groups of experiments on Wistar rats with the modeling of chronic fibrotic liver injury (n = 70): I group control (n = 20); in the II group (n = 20) a suspension of liver cells was transplanted into liver; in the III group (n = 30) cell-engineering designs (CED), which contained liver cells and BM MMSC, enclosed in a heterogeneous biodegradable gel “Sphero®GEL-long” were transplanted into damaged liver. The activity of recovery processes was evaluated by using biochemical and morphological methods in dynamics on 30, 60, 90 and 180 days. Results. It was shown that in the II and III gr. significantly accelerated the recovery processes in damaged livers compared with the I gr. The normalization of biochemical parameters took place in II and III du- ring 30 days instead of 90 days in the I group. However, the normalization of morphological signs of hepatocytes theirs viability and a degree of defibrotic changes in liver were more pronounced and prolonged in the III group. A study showed integration of CED by liver structures with formation of new bile ducts after 90 and 180 days. Conclusion. Higher levels and prolonged periods of recovery processes in damaged liver after CED transplanta- tion were due to the creation of biologically appropriate conditions for prolonged cell activity, included in their structure (donor liver cells and BM MMSC). Цель исследования. Разработка метода пролонгированной восстановительной регенерации поврежденной печени. Материалы и методы. На крысах Вистар с хроническим фиброзирующим повреждением печени (n = 70) выполнено 3 группы опытов: I гр. (n = 20) – контроль; во II гр. (n = 20) трансплантировали суспензию клеток печени; в III гр. (n = 30) в печень трансплантировали клеточно-инженерные конструкции (КИК): клетки печени и ММСК КМ в биодеградируемом геле «Сферо®ГЕЛЬ-лонг». Восстановительную регенерацию оценивали, используя биохимические и морфологические методы на 30, 60, 90 и 180-е сут. Результаты. Показано, что во II и III гр. достоверно ускоряются процессы восстановительной регенерации в поврежденной печени по сравнению с I гр. Нормализация биохимических показателей во II и III гр. наступала в сроках до 30 сут вместо 90 сут в I группе. Нормализация морфологических показателей, степень дефиброзирования и жизнеспособность гепатоцитов более выражена и пролонгирована в III гр. на всех сроках. Выявлена интеграция КИК структурами печени с формированием новых желчных протоков через 90 и 180 сут. Заключение. Более высокий уровень и пролонгированные сроки регенерации печени при трансплантации КИК обусловлены созданием в КИК биологически адекватных условий для пролонгированной жизнедеятельности клеток, включенных в их структуру.

Экспериментальная ортотопическая имплантация тканеинженерной конструкции трахеи, созданной на основе заселенного мезенхимальными и эпителиальными клетками девитализированного матрикса

Objective: to study the viability of a tissue-engineered graft (TEG) based on a devitalized tracheal scaffold (DTS) seeded with mesenchymal stromal and epithelial cells in an experiment on rabbits with assessment of cytocompatibility and biocompatibility in vivo. Materials and methods. Syngeneic mesenchymal stromal bone marrow cells (MSBMCs) and syngeneic lung epithelial cells of rabbit were obtained. The morphology and phenotype of the MSBMC culture were confirmed via immunofluorescence staining for CD90 and CD271 markers. Pulmonary epithelial cells obtained by enzymatic treatment of minced rabbit lung tissue were stained with CKPan, CK8/18 and CK14 markers characteristic of epithelial cells. The donor trachea was devitalized in three successive freezethawing cycles. Double-layer cell seeding of DTS was performed under static and dynamic culturing. Orthotopic implantation of TEGs was performed at the site of the anterolateral wall defect in the rabbit that was formed as a result of tracheal resection over four rings. Results were evaluated by computed tomography, histological and immunohistochemical analyzes. Results. A TEG implant, based on DTS, with bilayer colonization by cell cultures of rabbit MSBMC and epithelial cells was obtained. Three months after implantation, TEG engraftment was noted, no tracheal wall stenosis was observed. However, slight narrowing of the lumen in the implantation site was noted. Six months after implantation, viability of TEG was confirmed by histological method. Epithelialization and vascularization of the tracheal wall, absence of signs of purulent inflammation and aseptic necrosis were shown. The small narrowing of the lumen of trachea was found to have been caused by chronic inflammation due to irritation of the mucous membrane with suture material. Conclusion. A new model for assessing the viability of a tissue engineering implant when closing a critical airway defect was created. The developed TEG – based on DTS seeded (bilayer) by lung epithelial cells and BMSCs – was successfully used to replace non-extended tracheal defects in an in vivo experiment. The use of tracheal tissue-engineered graft for orthotopic implantation showed biocompatibility with minimal tissue response.Цель. Изучить жизнеспособность тканеинженерной конструкции (ТИК) на основе девитализированного трахеального матрикса (ДТМ), заселенного мезенхимальными стромальными и эпителиальными клетками, на модели оценки жизнеспособности тканеинженерного имплантата при закрытии критического дефекта дыхательных путей у кроликов. Оценить потенциал ТИК к поддержанию стабильного просвета трахеи в области имплантации. Материалы и методы. Получены сингенные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга (МСК КМ) и сингенные эпителиоциты легкого кролика. Морфологию и фенотип культуры МСК КМ подтверждали иммунофлюоресцентным окрашиванием на маркеры CD90 и CD271. Клетки легочного эпителия, полученные методом энзиматической обработки измельченной ткани легкого кролика, были окрашены на характерные для эпителиальных клеток маркеры CKPan, CK8/18 и CK14. Девитализация донорской трахеи проведена тремя последовательными циклами замораживания–оттаивания. Двухслойное заселение ДТМ клетками выполнено в условиях статичного и динамического культивирования. Проведена ортотопическая имплантация ТИК на место дефекта переднебоковой стенки трахеи кролика, сформированного в результате резекции трахеи на протяжении четырех колец. Оценка результатов выполнена методами компьютерной томографии, гистологического и иммуногистохимического анализов. Результаты. Получен имплантат ТИК на основе ДТМ с двухслойным заселением клеточными культурами МСК КМ и эпителиоцитов кролика. Через 3 мес. после имплантации отмечалось приживление ТИК, стенозирования стенки трахеи не наблюдалось, однако отмечалось незначительное сужение просвета в области имплантации. На 6-й мес. после имплантации жизнеспособность тканеинженерной конструкции подтверждалась гистологическим методом. Показана эпителизация и васкуляризация стенки трахеи, отсутствие признаков гнойного воспаления и асептического некроза. Определена причина небольшого сужения просвета трахеи хроническое воспаление, вызванное раздражением слизистой шовным материалом. Заключение. Получена модель для оценки жизнеспособности тканеинженерного имплантата при закрытии критического дефекта дыхательных путей. Разработанная ТИК на основе ДТМ, двухслойно заселенного эпителиоцитами легкого и МСК КМ, была успешно применена для замещения непротяженных дефектов трахеи в эксперименте in vivo. Минимальная тканевая реакция на ТИК трахеи была обусловлена биосовместимостью имплантата

ROLE OF LIVER SINUSOIDAL CELLS AND BONE MARROW CELLS IN REALIZATION OF REGENERATIVE STRATEGY OF NORMAL AND DAMAGED LIVER

Sinusoidal cells play the key role at all kinds of liver regeneration (physiological, reparative, fibrogenetic), which vector depends on adaptative reserves of these cells (first of all Ito cells) stressful damaging factors affect. It was demonstrated that under reparative liver regeneration the recovery of hepatocytes pool originates not only from mitosis, but from regional stem cells – oval cells, Ito cells and from migrating bone marrow cells. Fibrogenetic liver regeneration occurs as a result of inhibiting stem cell function of Ito cells and bone marrow cells