Análise abrangente de variantes de GNPTAB associadas à atividade deficiente da GlcNAc-1-fosfotransferase

As hidrolases lisossômicas são peptídeos sintetizados em ribossomos acoplados à membrana, e concomitantemente incorporados ao lúmen do retículo endoplasmático. Ainda nessa organela, essas proteínas são modificadas com oligossacarídeos padrão em resíduos de asparaginas contidos em sua estrutura primária. A geração de resíduos de manose-6-fosfato (M6P) nos oligossacarídeos presentes nas hidrolases lisossômicas garante o direcionamento destas aos compartimentos lisossomais. A primeira etapa da geração de M6P é realizada pela GlcNAc-1-fosfotransferase, que é residente da porção cis do complexo de Golgi, e realiza o reconhecimento das hidrolases e a transferência de um resíduo de GlcNAc-1-fosfato do doador UDP-GlcNAc para o resíduo de manose na posição 6 do oligossacarídeo presente na hidrolase. A GlcNAc-1-fosfotransferase é um complexo hexamérico formado por duas subunidades α, β e γ (α²β²γ²), onde as duas primeiras são codificadas pelo gene GNPTAB e a terceira pelo gene GNPTG. Variantes patogênicas identificadas no gene GNPTAB causam as doenças lisossômicas raras Mucolipidoses (ML) II e III alfa/beta, e variantes em GNPTG causam a ML III gama. Essas doenças são graves e caracterizadas por um extravasamento de hidrolases lisossômicas ao ambiente extracelular e, consequentemente, a ausência destas nos compartimentos lisossomais, o que ocasiona um acúmulo de macromoléculas não degradadas. Objetivos: 1) Caracterizar os mecanismos fisiopatológicos de variantes patogênicas de GNPTAB; 2) Caracterizar pacientes brasileiros com ML II e III alfa/beta em relação a variantes patogênicas em GNPTAB. Metodologia: Etapa 1 - estudo in vitro, no qual construtos contendo as variantes p.Asp76Gly, p.Ser385Leu, p.Glu389Lys, p.Asp408Asn, p.His956Tyr, p.Arg986Cys e p.Leu1168Glnfs*5 do gene GNPTAB foram geradas através de mutagênese sítio-dirigida, e transfectados por 24 horas em células HEK ou HeLa em condições normais de cultura celular. Extratos celulares foram avaliados através de deglicosilação enzimática, western blotting, imunofluorescência e microscopia confocal, e atividade enzimática residual. Etapa 2 - estudo transversal com amostragem por conveniência, no qual foi obtida amostra de DNA genômico ou RNA total de 18 pacientes não relacionados com ML II (n=10) ou III (n=8). O gene GNPTAB foi analisado através de sequenciamento de Sanger (n=17) e sequenciamento de nova geração (n=1). As variantes do tipo troca de sentido, ainda não descritas na literatura, foram pesquisadas em 200 alelos controles brasileiros. Etapa 3 - estudo retrospectivo que incluiu 32 pacientes brasileiros não relacionados (consanguinidade, n=6/32) com diagnóstico clínico 9 e genético de ML II/III alfa/beta. A frequência regional dos alelos alterados foi determinada. Resultados: Etapa 1 – as variantes p.Ser385Leu, p.Glu389Lys, p.Asp408Asn, p.His956Tyr e p.Arg986Cys são expressas, transportadas e clivadas por S1P de maneira comparável à proteína selvagem, contudo todos os mutantes apresentam atividade residual inferior a 5%. Já a proteína mutante p.Asp76Gly é modificada com estruturas de glicosilação, permanece retida no retículo endoplasmático e, por consequência, possui atividade residual indetectável. Etapa 2 - O genótipo foi determinado em 18 pacientes (ML II= 10, III alfa/beta= 8). Um total de 16 diferentes variantes foram encontradas, sendo nove ainda não descritas na literatura: r.86_116conNM_024312.5:19_49, c.227A>G, c.831delT, c.1154C>T, c.1763insA, c.1927delAATT, c.2034dup, c.2720_2721del e c.3333T>G. Somente as variantes c.3503_3504del (n=10/31), c.1208T>C(n=4/31), c.242G>T (n=3/31) e c.2249dup (n=2/31 alelos) foram recorrentes. Etapa 3 - Os pacientes eram originários de todas as regiões do Brasil (Sudeste n=14, Nordeste n=10, Sul n=4, Centro-oeste n=3, Norte n=1), sendo 6/32 consanguíneos. As variantes mais prevalentes foram a c.3503_3504del (n= 19, Nordeste n=9, Sudeste n=4, Centro-oeste n=4, Sul n=2), associada à forma grave da doença, e a c.1208T>C (n= 6, Nordeste n=3, Sudeste n=2, Centro-oeste n=1), associada à forma mais branda. A variante c.3503_3504del é a mais frequentemente encontrada nas regiões Centro-oeste, Nordeste e Sudeste do Brasil, enquanto a c.1196C>T é identificada em 42,8% dos alelos da região Sul. Conclusões: a caracterização do impacto funcional de variantes do tipo troca de sentido permitem concluir que os resíduos p.Glu389, p.Asp408, p.His956 e p.Arg986 são importantes para a função da catalítica da GlcNAc-1-fosfotransferase, enquanto que o aminoácido p.Asp76 pode estar envolvido no transporte da enzima ao complexo de Golgi. A análise genética dos pacientes brasileiros com ML II e III confirma a alta heterogeneidade genética e a alta frequência de variantes patogênicas privadas do gene GNPTAB, além de reiterar a variante c.3503_3504del como a predominantemente identificada nessa população. Sob a perspectiva de todos os pacientes diagnosticados com ML II/III no Brasil, é possível concluir que diferentes regiões apresentam frequências alélicas de variantes patogênicas específicas, o que pode ser explicado através da ocorrência de efeito fundador ou altas taxas de consanguinidade, ou uma combinação de ambas.Lysosomal hydrolases are peptides synthesized in ribosomes attached to the membrane, and concomitantly incorporated to the lumen of the endoplasmic reticulum. Still in this organelle, these proteins are modified with standard oligosaccharides in asparagine residues contained in their primary structure. The generation of mannose-6-phosphate (M6P) residues in the oligosaccharides present in lysosomal hydrolases guarantees the direction of these to the lysosomal compartments. The first stage of M6P generation is performed by GlcNAc-1-phosphotransferase, which is resident in the cis portion of the Golgi complex, and performs the recognition of the hydrolases and the transfer of a residue of GlcNAc-1-phosphate from the UDP-GlcNAc donor to the mannose residue in position 6 of the oligosaccharide present in the hydrolase. GlcNAc-1-phosphatetransferase is a hexameric complex formed by two subunits α, β and γ (α²β²γ²), where the first two are encoded by the GNPTAB gene and the third by the GNPTG gene. Pathogenic variants identified in the GNPTAB gene cause rare lysosomal diseases Mucolipidosis (ML) II and III alpha/beta, and variants in GNPTG cause the ML III gamma. These diseases are severe and characterized by an overflow of lysosomal hydrolases into the extracellular environment and, consequently, their absence in lysosomal compartments, which causes an accumulation of non-degraded macromolecules. Objectives: 1) To characterize pathophysiological mechanisms of GNPTAB pathogenic variants; 2) To characterize Brazilian patients with ML II and III alpha/beta in relation to GNPTAB pathogenic variants. Methodology: Section 1 - in vitro study, in which constructs containing the variants p.Asp76Gly, p.Ser385Leu, p.Glu389Lys, p.Asp408Asn, p.His956Tyr, p.Arg986Cys and p.Leu1168Glnfs*5 of the GNPTAB gene were generated by site-directed mutagenesis, and transfected for 24 hours in HEK or HeLa cells under normal cell culture conditions. Cell extracts were evaluated by enzymatic deglycosylation, western blotting, immunofluorescence and confocal microscopy, and residual enzymatic activity. Section 2 - cross-sectional study with convenience sampling, in which a sample of genomic DNA or total RNA was obtained from 18 patients unrelated ML II (n=10) or III alpha/beta (n=8). The GNPTAB gene was analyzed through Sanger sequencing (n=17) and new generation sequencing (n=1). Missense variants not described in the literature were researched in 200 Brazilian control alleles. Section 3 - retrospective study that included 32 unrelated Brazilian patients (consanguinity, n=6/32) with clinical and genetic diagnosis of ML II/III alpha/beta. The regional frequency of the altered alleles was determined. Results: 11 Section 1 - the variants p.Ser385Leu, p.Glu389Lys, p.Asp408Asn, p.His956Tyr and p.Arg986Cys are expressed, transported and cleaved by S1P as the wildtype protein, however all mutants present residual activity lower than 5%. The p.Asp76Gly mutant is modified with glycosylation structures, remains retained in the endoplasmic reticulum and, consequently, has undetectable residual activity. Section 2 - The genotype was determined in 18 patients (ML II= 10, III alpha/beta= 8). A total of 16 different variants were found, nine of which have not yet been described in the literature: r.86_116conNM_024312.5:19_49, c.227A>G, c.831delT, c.1154C>T, c.1763insA, c.1927delAATT, c.2034dup, c.2720_2721del and c.3333T>G. Only variants c.3503_3504del (n=10/31), c.1208T>C (n=4/31), c.242G>T (n=3/31) and c.2249dup (n=2/31 alleles) were recurrent. Section 3 - The patients were from all regions of Brazil (Southeast n=14, Northeast n=10, South n=4, Midwest n=3, North n=1), with 6/32 being consanguineous. The most prevalent variants were c.3503_3504del (n=19, Northeast n=9, Southeast n=4, Midwest n=4, South n=2), associated with the severe form of the disease, and c.1208T>C (n=6, Northeast n=3, Southeast n=2, Midwest n=1), associated with the milder form. Variant c.3503_3504del is the most frequently found in the Midwest, Northeast, and Southeast regions of Brazil, while c.1196C>T is identified in 42.8% of the alleles in the South. Conclusions: The characterization of the functional impact of missense variants allows the conclusion that the p.Glu389, p.Asp408, p.His956 and p.Arg986 residues are important for the catalytic function of GlcNAc-1-phosphotransferase, while the amino acid p.Asp76 may be involved in the transport of the enzyme to the Golgi complex. The genetic analysis of Brazilian patients with ML II and III alpha/beta confirms the high genetic heterogeneity and the high frequency of individual pathogenic variants of the GNPTAB gene, and reiterates the variant c.3503_3504del as the predominant one identified in this population. From the perspective of all patients diagnosed with ML II/III in Brazil, it is possible to conclude that different regions present allelic frequencies of specific pathogenic variants, which can be explained by the occurrence of a founding effect or high inbreeding rates, or a combination of both

In vitro substrate reduction, chaperone and immunomodulation treatments reduce heparan sulfate in mucolipidosis III human fibroblasts

Abstract Mucolipidosis II and III (MLII and MLIII) are autosomal recessive diseases caused by pathogenic variants in GNPTAB and GNPTG genes that lead to defects in GlcNAc-1-phosphotransferase. This enzyme adds mannose 6-phosphate residues to lysosomal hydrolases, which allows enzymes to enter lysosomes. Defective GlcNAc-1-phosphotransferase causes substrate accumulation and inflammation. These diseases have no treatment, and we hypothesized that the use of substrate reduction therapy and immunomodulation may be beneficial at the cell level and as a future therapeutic approach. Fibroblasts from two patients with MLIII alpha/beta and 2 patients with MLIII gamma as well as from one healthy control were treated with 10 µM miglustat, 20 µM genistein, and 20 µM thalidomide independently. ELISA assay and confocal immunofluorescence microscopy were used to evaluate the presence of heparan sulfate (HS) and the impact on substrate accumulation. ELISA assay showed HS reduction in all patients with the different treatments used (p=0.05). HS reduction was also observed by immunofluorescence microscopy. Our study produced encouraging results, since the reduction in substrate accumulation, even partial, may offer benefits to the phenotype of patients with inborn errors of metabolism

Humoral immune response in adult Brazilian patients with mucolipidosis III gamma

Mucolipidosis II and III (ML II and III) alpha/beta and ML III gamma are lysosomal diseases caused by GlcNAc-1-phosphotransferase deficiency. Previous data indicate that MLII patients have functionally impaired immune system that contributes to predisposition to infections.We evaluated the immunological phenotype of three Brazilian patients with ML III gamma. Our data suggest that the residual activity of GlcNAc-1-phosphotransferase in patients with ML III gamma is enough to allow the targeting of the lysosomal enzymes required for B-cell functions maintenance

Análise do gene GNPTAB em pacientes brasileiros com mucolipidose II/III

Introdução: A rede lisossômica é um complexo de vias metabólicas que influenciam processos como degradação de organelas danificadas ou senescentes, processamento de antígenos, reutilização de aminoácidos essenciais e, em última instância, um sistema de fundamental importância para a fisiologia celular normal. Nesse contexto, os lisossomos possuem uma relevância muito grande, uma vez que é nessa organela que ocorre a destruição das moléculas envolvidas em todos os processos citados acima. Entre as unidades operacionais nos lisossomos estão as hidrolases lisossômicas, que são mais de 50 enzimas com capacidade, em ambiente ácido, de realizar a quebra de substratos específicos. A GlcNAc-fosfotransferase é um complexo hexamérico (J2K2L2) residente na porção cis do complexo de Golgi que realiza a adição de resíduos de manose-6- fosfato nas cadeias de oligossacarídeos das hidrolases lisossômicas. Com ação subsequente, a enzima descobridora realiza a remoção da manose, expõe os resíduos de fosfato e possibilita que as hidrolases sejam reconhecidas pelos receptores de manose-6- fosfato e direcionadas aos compartimentos lisossomais. As subunidades J e K da GlcNAc-fosfotransferase são codificadas pelo gene GNPTAB, localizado no cromossomo 12, constituído de 21 éxons, e a subunidade L pelo gene GNPTG, localizado no cromossomo 16, constituído de 11 éxons. Alterações patogênicas em GNPTAB podem causar as doenças Mucolipidose II ou III alfa/beta e alterações em GNPTG causam a doença Mucolipidose III gama. O defeito genético leva à atividade residual, ou nula, da enzima que acaba por gerar o extravasamento das hidrolases lisossômicas ao meio extracelular e o acúmulo de substratos nos lisossomos. Objetivos: (1) caracterizar as alterações patogênicas em GNPTAB em um grupo de pacientes brasileiros não relacionados com Mucolipidose II ou III alfa/beta, e (2) definir um protocolo de pesquisa molecular para os pacientes brasileiros. Metodologia: É um estudo transversal, com amostragem por conveniência, e inclui pacientes com diagnóstico clínico e bioquímico de Mucolipidose II ou III. Foi extraído DNA genômico dos pacientes a partir de sangue obtido por punção venosa periférica. O gene GNPTAB foi sequenciado através da técnica de Sanger. As alterações do tipo troca de sentido foram analisadas pelos programas de Bioinformática Polyphen2, Sift e Consurf, e as preditas como patogênicas foram pesquisadas em alelos controles brasileiros e analisadas por estudos funcionais, quando possível. A geração de construtos das alterações p.Ser385Leu e c.3503_3504delTC foi realizada por mutagênese sítio-dirigida e a atividade residual destes foi avaliada 24 horas após expressão em células HEK. Para a análise financeira, valores atuais de equipamentos, reagente de biologia molecular e materiais plásticos foram utilizados para estimar o custo de uma extração de DNA, reação de PCR, purificação com PEG8000 e sequenciamento. Resultados: Foram incluídos 13 pacientes (ML II= 8; ML III= 5) e, adicionalmente, de uma mãe de paciente com diagnóstico clínico e bioquímico de ML II. A análise molecular identificou seis alterações patogênicas novas, as c.831delT, c.1763insA, c.1927delAATT, p.Ser385Leu, p.(Asp76Gly) e p.Try1111*. A análise de bioinformática das alterações do tipo troca de sentido as caracterizaram como prejudiciais para a função da proteína e os resíduos 76 e 385 como estrutural e funcional, respectivamente, além de ambos como altamente conservados entre as espécies. A análise funcional dos mutantes p.Ser385Leu e c.3503_3504delTC identificaram atividades residuais de 1,5% e nula, respectivamente. Também foram identificadas outras seis alterações patogênicas previamente descritas. A alteração c.3503_3504delTC foi a que apresentou a maior frequência (40%, n= 10/25 alelos), seguido pela p.Ile403The (12%, n=3/25 alelos). Quanto às relações genótipo-fenótipo, sete pacientes com ML II possuem genótipos combinados de alterações do tipo mudança de fase de leitura e sem sentido, enquanto que os cincos pacientes com ML III alfa/beta apresentam pelo menos uma alteração do tipo troca de sentido, o que evidencia a relação entre alterações que impactam a funcionalidade da proteína e fenótipos mais graves. A análise retrospectiva definiu o protocolo 1.0 que finalizaria o diagnóstico com um custo médio de R$338,45, em uma amostra de 25 pacientes. A análise prospectiva do protocolo 2.0, sobre a mesma amostra de pacientes, indicou que o mesmo finalizaria o diagnóstico com o custo médio de R$ 299,80, uma economia de 25%. Discussão/Conclusão: As novas alterações patogênicas descritas nesse trabalho confirmam a alta heterogeneidade alélica do gene GNPTAB. A análise funcional da alteração p.Ser385Leu confirma sua patogenicidade, que está de acordo com o fenótipo ML II do paciente, e evidencia a necessidade de mais estudos a fim de constatar o motivo desse resíduo ser importante para a proteína. A síntese dos protocolos demonstrou ser uma estratégia interessante e economicamente importante, uma vez que diminui os gastos envolvidos para finalizar o diagnóstico molecular.Introduction: The lysosomal network is a complex of metabolic ways that influence processes like damaged or senescent organelles degradation, antigen processing, essential amino acid reutilization, and, in the last instance, it is important for normal cell physiology. In this context, lysosomes have a great relevance since it is in this organelle that the destruction of the molecules involved in all the processes mentioned above occurs. The operational units in the lysosomes are the lysosomal hydrolases that are more than 50 enzymes with capacity, in an acid environment, to breakdown specific substrates. GlcNAc-phosphotransferase is a hexameric complex (J2K2L2) located in the cis portion of the Golgi complex that performs the addition of mannose-6-phosphate residues in oligosaccharides chains on lysosomal hydrolases. In a subsequent way, the uncovering enzyme removes the mannose residues, exposes the phosphate residues, and enables the recognition of hydrolases by mannose-6-phosphate receptors. The J and K subunits are codified by GNPTAB gene, which is located in chromosome 12 and consists of 21 exons, and the L subunit, encoded by GNPTG gene, that is located in chromosome 16 and consists of 11 exons. The consequences of pathogenic alterations in GNPTAB are Mucolipidosis II or III alpha/beta diseases and alterations in the GNPTG are Mucolipidosis III gamma disease. The genetic defect leads to residual or absent activity of enzyme which ultimately generates an overflow of lysosomal hydrolases to the extracellular environment and accumulation of substrates in lysosomes. Objectives: (1) to characterize, by sequencing of the GNPTAB gene, the pathogenic alterations in a group of unrelated Brazilian patients with Mucolipidosis II or III alpha/beta, and (2) to define a molecular research protocol for Brazilian patients. Methodology: It is a crosssectional study with convenience sampling, and it includes patients with biochemical and clinical diagnosis of Mucolipidosis II or III. The DNA was amplified by PCR technique and sequencing by Sanger technique. All patients in the present study had all exons amplified. The missense alterations were analyzed by Polyphen2, Sift, and ConSurf softwares, and the alterations predicted as pathogenic were studied through research in Brazilian control alleles. The p.Ser385Leu and c.3503_3504delTC were evaluated by site-direct mutagenesis and the residual activity was evaluated 24 hours after expression in HEK cells, through radioactive assays. For cost-price analysis, current values for equipment, molecular biology reagents, and plastic materials were utilized to estimate the cost of DNA extraction, PCR reaction, PEG8000 purification, and sequencing. Results: Of the 13 patients, 8 were clinically diagnosed with Mucolipidosis II and 5 with Mucolipidosis III alpha/beta and, additionally, a mother of one patient with biochemical and clinical diagnosis of Mucolipidosis II was also analyzed. The DNA analysis identified six novel pathogenic alterations in GNPTAB: c.831delT, c.1763insA, c.1927delAATT, p.Ser385Leu, p.(Asp76Gly), and p.Tyr1111*. The bioinformatics analysis of missense alterations were characterized as damaging for protein function, and residues 76 and 385 as structural and functional, respectively, and both as highly conserved among the species. The functional analysis of mutants p.Ser385Leu and c.3503_3504delTC showed the residual activity of GlcNAcphosphotransferase of 1.5% and 0%, respectively. Six others pathogenic alterations previously described were also identified. The alteration c.3503_3504delTC showed the highest frequency (40%, n=10/25 alleles) followed by p.Ile403The (12%, n=3/25 alleles). The retrospective analysis defined the 1.0 protocol that finalized the molecular diagnosis at the cost of R$338,45 per sample, in a group of 25 patients. The prospective analysis of 2.0 protocol, in the same patients, indicated that it would finalize diagnosis at the cost of R$ 299,80 per sample, a saving of 25%. Discussion/Conclusion: The novel pathogenic alterations described confirm the high allelic heterogeneity of GNPTAB gene. In the genotype-phenotype relationship, 7 patients with Mucolipidosis II have combined genotype of frameshift or nonsense alterations, or both, and 5 Mucolipidosis III alpha/beta patients have at least one missense alteration, that shows the correlation between alterations that cause impact on the protein function and severe phenotype. The functional analysis of alteration p.Ser385Leu confirms its pathogenicity and makes evident the need of more studies in order to determine the reason this residue is so important for protein function. Protocol synthesis proves to be an interesting and economically important strategy, once it decreases costs to conclude the molecular diagnosis