Obtención y purificación de la cisteína sintasa de L. infantum

La leishmaniosis es una enfermedad tropical producida por parásitos del género Leishmania y que se manifiesta de diferentes formas algunas como el kala-azar con una gran mortalidad si no se administra tratamiento. El parasito, una vez ha infectado al huésped tras la picadura del insecto vector del género Phlebotomus o Lutzomia, es fagocitado por los monocitos y macrófagos dentro de los cuales produce la infección. Una línea de investigación para el desarrollo de medicamentos contra la infección parasítica consiste en buscar inhibidores de los mecanismos que permiten al protozoo mantenerse dentro de los macrófagos y que le hacen sobrevivir a las condiciones extremas de pH y estrés oxidativo que aparecen en los fagolisosomas. Uno de los mecanismos empleados por los parásitos para hacer frente al estrés oxidativo consiste en un metabolismo de tioles muy desarrollado que permite contrarrestar la oxidación. Debido a esto, resulta muy interesante estudiar las rutas de síntesis de cisteína, componente fundamental del glutatión y tripanotión, moléculas esenciales para el mantenimiento del correcto estado redox del parásito. Una de las rutas más interesantes es la que involucra a la cisteína sintasa ya que es una ruta que no aparece en humanos, lo que la pondría en una posición envidiable como diana terapéutica para el tratamiento de la infección. Se ha visto además que la sobreexpresión de esta enzima causa un aumento de la supervivencia bajo condiciones de estrés oxidativo. Por ello se busca obtener un protocolo para la obtención de esta enzima en una forma activa, lo que permitiría proseguir con ensayos de inhibición para probar compuestos que podrían resultar útiles para combatir la enfermedad

Introducción del sistema CRISPR/Cas9 en "Leishmania infantum"

El sistema procariota CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats /CRISPR-associated) ha sido adaptado para desarrollar una técnica de edición genómica con gran especifidad. Este sistema consiste en un RNA guía que conduce a la proteína Cas9 a una secuencia diana dentro del genoma para generar un corte de doble cadena, provocando la deleción de genes o la introducción de etiquetas. En el género de parásitos Leishmania, la complejidad de su genoma ha dificultado la implantación de otras técnicas de ingeniería génica. Sin embargo, el sistema CRISPR/Cas9 ha demostrado ser eficiente en estos organismos. En 2015, se delecionó por primera vez un gen en el género Leishmania, concretamente enla especie Leishmania major, mediante esta técnica. El objetivo del presente trabajo ha sido la puesta a punto del mismo sistema CRISPR/Cas9 en Leishmania infantum realizando la deleción del gen que codifica para la proteína fluorescente verde (GFP). Para ello, se transfectaron parásitos portadores del gen de GFP con el vector pTCas9 para conseguir una expresión de la proteína Cas9. Por otra parte, se modificó un vector, pLS, el cual expresaba el RNA guía y contenía un “cassette” donador de DNA que confiere resistencia a puromicina a los parásitos con el gen de GFP delecionado. Este vector se transfectó en los parásitos bajo cuatro condiciones diferentes: 100 μg y 15 μg de vector circular y 100 μg y 15 μg de vector lineal. Mediante citometría de flujo, determinando la fluorescencia de los parásitos, se observó una disminución de parásitos con expresión de GFP, lo que indicó que el gen había sido delecionado. De las cuatro condiciones utilizadas, la única condición eficaz fue la transfección de 100 μg de vector pLS circular. Este sistema ha demostrado no ser 100% eficaz por lo que es necesario el aislamiento de parásitos con el gen de GFP delecionad

Purificación y estudio de la actividad enzimática de las superóxido dismutasas glicosomales de "Leishmania infantum"

La leishmaniosis es una enfermedad parasitaria causada por especies del género Leishmania, unos protozoos flagelados que infectan los macrófagos de sus hospedadores vertebrados. Estos parásitos son capaces de sobrevivir al estrés oxidativo del fagolisosoma gracias a un conjunto de enzimas antioxidantes, entre las que se encuentra la superóxido dismutasa (SOD). La SOD es una enzima dimérica capaz de dismutar los radicales superóxido en peróxido de hidrógeno y oxígeno. En Leishmania, a diferencia del ser humano, las SODs poseen como cofactor un átomo de hierro. Estos parásitos poseen 4 isoformas de la SOD: dos glicosomales (SODB1 y SODB2) y dos mitocondriales (SODA y SODC). Los glicosomas son unos orgánulos que compartimentan una gran variedad de rutas metabólicas en estos parásitos. Algunas de ellas, como la β-oxidación de ácidos grasos, generan especies reactivas de oxígeno (ROS), entre los que se encuentran los radicales superóxido, que son retirados de los glicosomas gracias a SODB1 y SODB2. Algunos autores han demostrado que el knock-down simultáneo de ambas enzimas en Trypanosoma brucei reduce drásticamente la supervivencia de estos parásitos. Por estos motivos, SODB1 y SODB2 podrían ser unas buenas dianas terapéuticas. En este trabajo hemos realizado el clonaje de los genes que codifican las enzimas SODB1 y SODB2 de Leishmania infantum con objeto de expresar estas proteínas unidas a una etiqueta molecular de 6 histidinas que permite su purificación mediante una cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (IMAC). Nuestro trabajo permite concluir que la expresión óptima de His6-SODB1 se obtiene tras una inducción de 2 horas a 16ºC. En el caso de His6-SODB2 los mejores resultados se obtuvieron tras 4 horas a 16ºC. Las proteínas SODB1 y SODB2 escindidas de su tag His6 presentaron una pureza de un 97.4% y un 93.9%, respectivamente. Finalmente, se realizó un ensayo de actividad con el que se confirmó que ambas enzimas son funcionale

Identification of NEK3 and MOK as novel targets for lithium

Lithium ion, commonly used as the carbonate salt in the treatment of bipolar disorders, has been identified as an inhibitor of several kinases, including Glycogen Synthase Kinase-3ß, for almost 20 years. However, both the exact mechanism of enzymatic inhibition and its apparent specificity for certain metalloenzymes are still a matter of debate. A data-driven hypothesis is presented that accounts for the specificity profile of kinase inhibition by lithium in terms of the presence of a unique protein environment in the magnesium-binding site. This hypothesis has been validated by the discovery of two novel potential targets for lithium, namely NEK3 and MOK, which are related to neuronal function.Ministerio de Economía y Competitivida

Next generation of selenocyanate and diselenides with upgraded leishmanicidal activity

Nowadays, leishmaniasis is still treated with outdated drugs that present several obstacles related to their high toxicity, long duration, parenteral administration, high costs and drug resistance. Therefore, there is an urgent demand for safer and more effective novel drugs. Previous studies indicated that selenium compounds are promising derivatives for innovative therapy in leishmaniasis treatment. With this background, a new library of 20 selenocyanate and diselenide derivatives were designed based on structural features present in the leishmanicidal drug miltefosine. Compounds were initially screened against promastigotes of L. major and L. infantum and their cytotoxicity was evaluated in THP-1 cells. Compounds B8 and B9 were the most potent and less cytotoxic and were further screened for the intracellular back transformation assay. The results obtained revealed that B8 and B9 showed EC50 values of 7.7 µM and 5.7 µM, respectively, in L. major amastigotes, while they presented values of 6.0 µM and 7.4 µM, respectively, against L. infantum amastigotes. Furthermore, they exerted high selectivity (60 70) towards bone marrow-derived macrophages. Finally, these compounds exhibited higher TryR inhibitory activity than mepacrine (IC50 7.6 and 9.2 µM, respectively), and induced nitric oxide (NO) and reactive oxygen species (ROS) production in macrophages. These results suggest that the compounds B8 and B9 could not only exert a direct leishmanicidal activity against the parasite but also present an indirect action by activating the microbicidal arsenal of the macrophage. Overall, these new generation of diselenides could constitute promising leishmanicidal drug candidates for further studies

Pyridazino-pyrrolo-quinoxalinium salts as highly potent and selective leishmanicidal agents targeting trypanothione reductase

Fifteen pyridazino-pyrrolo-quinoxalinium salts were synthesized and tested for their antiprotozoal activity against Leishmania infantum amastigotes. Eleven of them turned out to be leishmanicidal, with EC50 values in the nanomolar range, and displayed low toxicity against the human THP-1 cell line. Selectivity indices for these compounds range from 10 to more than 1000. Compounds 3b and 3f behave as potent inhibitors of the oxidoreductase activity of the essential enzyme trypanothione disulfide reductase (TryR). Interestingly, binding of 3f is not affected by high trypanothione concentrations, as revealed by the noncompetitive pattern of inhibition observed when tested in the presence of increasing concentrations of this substrate. Furthermore, when analyzed at varying NADPH concentrations, the characteristic pattern of hyperbolic uncompetitive inhibition supports the view that binding of NADPH to TryR is a prerequisite for inhibitor-protein association. Similar to other TryR uncompetitive inhibitors for NADPH, 3f is responsible for TryR-dependent reduction of cytochrome c in a reaction that is typically inhibited by superoxide dismutase.Comunidad de MadridMinisterio de Economía y CompetitividadMinisterio de Ciencia, Innovación y Universidade

Synthesis and Leishmanicidal Activity of Novel Urea, Thiourea, and Selenourea Derivatives of Diselenides

A novel series of thirty-one N-substituted urea, thiourea, and selenourea derivatives containing diphenyldiselenide entities were synthesized, fully characterized by spectroscopic and analytical methods, and screened for their in vitro leishmanicidal activities. The cytotoxic activity of these derivatives was tested against Leishmania infantum axenic amastigotes, and selectivity was assessed in human THP-1 cells. Thirteen of the synthesized compounds showed a significant antileishmanial activity, with 50% effective concentration (EC50) values lower than that for the reference drug miltefosine (EC50, 2.84¿¿M). In addition, the derivatives 9, 11, 42, and 47, with EC50 between 1.1 and 1.95¿¿M, also displayed excellent selectivity (selectivity index ranged from 12.4 to 22.7) and were tested against infected macrophages. Compound 11, a derivative with a cyclohexyl chain, exhibited the highest activity against intracellular amastigotes, with EC50 values similar to those observed for the standard drug edelfosine. Structure-activity relationship analyses revealed that N-aliphatic substitution in urea and selenourea is recommended for the leishmanicidal activity of these analogs. Preliminary studies of the mechanism of action for the hit compounds was carried out by measuring their ability to inhibit trypanothione reductase. Even though the obtained results suggest that this enzyme is not the target for most of these derivatives, their activity comparable to that of the standards and lack of toxicity in THP-1 cells highlight the potential of these compounds to be optimized for leishmaniasis treatment.Comunidad de MadridMinisterio de Economía y CompetitividadFoundation for Applied Medical Investigatio

Puesta a punto de ensayos de cuantificación de dimerización y actividad de la superóxido dismutasa de hierro A de "Leishmania infantum"

Los parásitos del género Leishmania son los agentes causales de la leishmaniasis. Estos parásitos tienen la capacidad de sobrevivir dentro de las vacuolas fagocíticas de los macrófagos a pesar de las condiciones de pH y estrés oxidativo allí generadas. Esta resistencia se debe a diversos mecanismos biológicos que comprenden enzimas de detoxificación de las especies reactivas de oxígeno, entre otras. Estas enzimas son potenciales dianas terapéuticas para el tratamiento de la leishmaniasis. Una de estas enzimas es la superóxido dismutasa que cataliza la dismutación del anión superóxido, una especie reactiva de oxígeno con capacidad de originar otras especies reactivas más tóxicas. Leishmania cuenta con 4 superóxido dismutasas de hierro. La superóxido dismutasa de hierro A (Fe-SODA) se localiza en la mitocondria, lugar de producción endógena de superóxido. Se ha visto que la Fe-SODA se sobrexpresa en las formas parasitarias que infectan los macrófagos y que protege de la muerte celular inducida por el tratamiento con miltefosina. En este trabajo se ha clonado, expresado y purificado la Fe-SODA de Leishmania infantum con dos “etiquetas” (tags) moleculares distintas que permiten generar una versión heterodimérica para la puesta a punto de dos ensayos que permitan evaluar la eficacia de compuestos dirigidos contra la enzima. Uno de los ensayos que se ha optimizado en este trabajo ha sido un ensayo de cuantificación de la dimerización basado en la técnica ELISA usando anticuerpos contra las dos etiquetas del heterodímero, uno para pegar a la placa y el otro para evaluar el porcentaje de enzima dimérica. El segundo ensayo está dirigido a medir la actividad catalítica de la enzima. El ensayo de actividad se basa en la producción de superóxido por el sistema xantina/xantina oxidasa y en la competencia por el superóxido entre la Fe-SODA y el citocromo c, una proteína que cambia de color al reducirse por el superóxid