Mapping key interactions in the dimerization process of HBHA from Mycobacterium tuberculosis, insights into bacterial agglutination

AbstractHBHA is a cell-surface protein implicated in the dissemination of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) from the site of primary infection. Its N-terminal coiled-coil region is also involved in bacterial agglutination. However, despite the importance of HBHA dimerization in agglutination, protein regions involved in dimerization are hitherto not known. Here, we mapped these regions by coupling peptide synthesis, biochemical and computational analyses, and identified structural determinants for HBHA monomer–monomer recognition. Importantly, we obtained the first molecule able to induce HBHA dimer disaggregation at 37°C, the typical growth temperature of Mtb. This result provides new opportunities towards the development of Mtb anti-aggregation molecules with therapeutic interest.Structured summary of protein interactionsHBHA and HBHA bind by molecular sieving (View interaction)HBHA and H1 peptide bind by competition binding (View Interaction)HBHA and H1ext peptide bind by competition binding (View Interaction)HBHA and H2ext peptide bind by competition binding (View Interaction)HBHA and H2 peptide bind by competition binding (View Interaction)HBHA and H2ext peptide bind by competition binding (View Interaction)HBHA and HBHA bind by blue native page (View interaction

Synthesis of temporin L hydroxamate-based peptides and evaluation of their coordination properties with iron (III)

Ferric iron is an essential nutrient for bacterial growth. Pathogenic bacteria synthesize iron-chelating entities known as siderophores to sequestrate ferric iron from host organisms in order to colonize and replicate. The development of antimicrobial peptides (AMPs) conjugated to iron chelators represents a promising strategy for reducing iron availability, inducing bacterial death, and enhancing simultaneously the efficacy of AMPs. Here we designed, synthesized, and characterized three hydroxamate-based peptides Pep-cyc1, Pep-cyc2, and Pep-cyc3, derived from a cyclic temporin L peptide (Pep-cyc) developed previously by some of us. The Fe3+ complex formation of each ligand was characterized by UVvisible spectroscopy, mass spectrometry, IR, and NMR spectroscopies. In addition, the effect of Fe3+ on the stabilization of -helix conformation of hydroxamate-based peptides and the cotton effect were examined by CD spectroscopy. Moreover, the antimicrobial results obtained in vitro on some Gram-negative strains (K. Pneumoniae and E. coli) showed the ability of each peptide to chelate efficaciously Fe3+ obtaining a reduction of MIC values in comparison to their parent peptide Pepcyc. Our results demonstrated that siderophore conjugation could increase the efficacy and selectivity of AMPs used for the treatment of infectious diseases caused by Gram-negative pathogens

Insights into the Interaction Mechanism of DTP3 with MKK7 by Using STD-NMR and Computational Approaches

GADD45β/MKK7 complex is a non-redundant, cancer cell-restricted survival module downstream of the NF-kB survival pathway, and it has a pathogenically critical role in multiple myeloma, an incurable malignancy of plasma cells. The first-in-class GADD45β/MKK7 inhibitor DTP3 effectively kills MM cells expressing its molecular target, both in vitro and in vivo, by inducing MKK7/JNK-dependent apoptosis with no apparent toxicity to normal cells. DTP3 combines favorable drug-like properties, with on-target-specific pharmacology, resulting in a safe and cancer-selective therapeutic effect; however, its mode of action is only partially understood. In this work, we have investigated the molecular determinants underlying the MKK7 interaction with DTP3 by combining computational, NMR, and spectroscopic methods. Data gathered by fluorescence quenching and computational approaches consistently indicate that the N-terminal region of MKK7 is the optimal binding site explored by DTP3. These findings further the understanding of the selective mode of action of GADD45β/MKK7 inhibitors and inform potential mechanisms of drug resistance. Notably, upon validation of the safety and efficacy of DTP3 in human trials, our results could also facilitate the development of novel DTP3-like therapeutics with improved bioavailability or the capacity to bypass drug resistance

Studio conformazionale di domini funzionali proteici

Il progetto di questo dottorato di ricerca riguarda lo studio conformazionale in soluzione di domini funzionali proteici, mediante l’uso della spettroscopia NMR e di metodi computazionali. In particolare, l’attenzione è stata rivolta allo studio di alcuni fattori di crescita. I fattori di crescita sono proteine coinvolte nella crescita, differenziazione e proliferazione cellulare. Queste proteine possono suddividersi in tre grandi gruppi: IGF (Insulin Growth Factor), FGF (Fibroblast Growth Factor), superfamiglia dei TGF- (Trasforming Growth Factor-beta). La superfamiglia dei TGF- comprende un grande numero di ligandi collegati strutturalmente che giocano un ruolo chiave nella progressione del ciclo cellulare. Un TGF- inizia la trasmissione del segnale (signaling) legandosi a recettori serina/treonina chinasi di tipo I e di tipo II presenti sulla superficie cellulare. In seguito a tale binding, c’è un avvicinamento dei recettori che permette al recettore di tipo II di fosforilare il dominio intracellulare del recettore di tipo I, che poi propaga il segnale attraverso la fosforilazione delle proteine Smad intracellulari. Si forma, quindi, un complesso di proteine Smad che viene traslocato nel nucleo dove va a regolare la trascrizione dei geni target dei TGF-. Poiché la superfamiglia dei TGF- interviene nella crescita e proliferazione cellulare, molti dei suoi membri sono over-espressi, o il loro normale meccanismo è mal regolato, nei casi di crescite anomale di cellule quali i tumori. Proprio questo loro coinvolgimento nella genesi e sviluppo tumorale ha suscitato un grosso interesse scientifico verso lo studio funzionale e strutturale dei TGF-. Tra i numerosi fattori di crescita, una famiglia con caratteristiche particolari è quella chiamata EGF-CFC, di cui la proteina Cripto è il capostipite. I fattori di crescita extracellulari EGF-CFC sono composti da due domini adiacenti ricchi di cisteine: EGF-like (Epidermal Growth Factor-like) e CFC (CRIPTO/FRL-1/Cryptic) di circa 40 residui ciascuno. La proteina Cripto è un elemento fondamentale per il signaling di Nodal, una proteina appartenente ai TGF-. In particolare, Cripto è il co-recettore di Nodal. Infatti, Nodal si lega al complesso recettoriale dell’attivina, formato dai recettori di tipo I (ALK4) e di tipo II (ActRIIB), solo in presenza di Cripto. In questo processo Cripto lega Nodal con il dominio EGF e lega ALK4 con il dominio CFC. Entrambi questi domini di Cripto interferiscono con l’attività onco-soppressiva delle attivine, o bloccando il recettore ALK4 o attraverso il legame all’attivina solubile. Sebbene entrambi i domini siano coinvolti nell’attività tumorigenica di Cripto, il dominio CFC ha un ruolo primario. Data l’importanza che la formazione di questa complessa rete di interazioni riveste, non solo nello sviluppo embrionale, ma anche nella proliferazione di cellule tumorali, è estremamente interessante ottenere informazioni strutturali sui vari fattori proteici coinvolti. Purtroppo, ad oggi, non sono note le strutture tridimensionali né in soluzione né allo stato solido di Cripto, di Nodal e del recettore ALK4. Quindi, nel corso di questo progetto di ricerca è stata intrapresa tale indagine strutturale. In particolare, siamo partiti dallo studio strutturale attraverso NMR in tampone fosfato del dominio CFC da topo e umano. I modelli molecolari ottenuti esibiscono una forma complessivamente ellissoidale e il folding è globalmente esteso con tre strand collegati dai tre ponti disolfuro. E’ importante notare che i residui ritenuti responsabili del binding con il recettore ALK4 (His9 e Trp12) non sono localizzati nel core proteico, ma si ritrovano posizionati tra la fine del primo strand e l’inizio del primo loop, con le catene laterali esposte esternamente. Opposto al sito di binding, è localizzato un cluster di residui idrofobici che potrebbe svolgere una funzione stabilizzante dell’intera struttura proteica attraverso binding col dominio EGF-like, oppure potrebbe essere rilevante per la formazione d’interazioni intermolecolari. Per approfondire lo studio strutturale sull’interazione del dominio CFC con il recettore ALK4, è stato costruito il modello per omologia del dominio extra-cellulare (ECD) di ALK4, basandosi sulla struttura cristallografica del recettore umano ALK3 (identità di sequenza 27 %) ed è stata modellata la struttura tridimensionale del complesso CFC/ALK4-ECD, usando docking macromolecolare assistito da dati sperimentali. Le soluzioni del docking sono state selezionate considerando i risultati degli studi di mutagenesi che indicano i residui H9 e W12 di CFC cruciali per il binding con il recettore ALK4. In base alle analisi condotte è stato scelto un modello rappresentativo del complesso CFC/ALK4-ECD che presenta buona complementarità di superficie, contatti elettrostatici e idrofobici favorevoli, basso valore dell’energia totale. Questo modello, consistente con i dati precedenti di mutagenesi, fornisce una base strutturale per la progettazione di analoghi modificati, che potranno confermare le ipotesi di interazione molecolare tra CFC ed ALK4 ed eventualmente funzionare come antagonisti. Infine, abbiamo puntato la nostra attenzione su Nodal. La proteina Nodal è un omodimero di 220 amminoacidi con 14 cisteine, che formano 6 ponti disolfuro intra-catena e uno inter-catena che lega i due monomeri. E’ stato costruito un modello per omologia sia del monomero sia del dimero della variante umana, utilizzando cinque templati. Il modello di Nodal ottenuto per homology modelling, conserva il nodo di cisteina caratteristico della superfamiglia dei TGF- ed è formato da due -sheet antiparalleli e un -elica perpendicolare ai -sheet. I modelli ottenuti conservano le regioni caratteristiche di binding del recettore di tipo I (‘wrist epitope’) e del recettore di tipo II (‘knucle epitope’) Contemporaneamente, per avere informazioni strutturali in soluzione di Nodal sono stati sintetizzati e caratterizzati tre frammenti, che riproducono tratti di sequenza presumibilmente coinvolti nel legame con i suoi partner proteici. L’ analisi conformazionale NMR evidenzia, nelle condizioni sperimentali adoperate, una fedele riproduzione strutturale dei relativi tratti nella proteina parente. Dall’insieme dei risultati ottenuti, sia mediante NMR che mediante homology modelling, si possono evidenziare elementi strutturali potenzialmente rilevanti per il binding con i recettori o altri partner proteici. In conclusione, questo lavoro di ricerca ha consentito l’acquisizione di informazioni strutturali, finora sconosciute, sulle componenti del complesso proteico che è alla base del meccanismo di signaling di Nodal via Cripto e ha permesso di formulare ipotesi sugli elementi strutturali rilevanti ai fini delle mutue interazioni. Per confermare tali ipotesi è stato avviato uno studio di binding “Real Time Bia” con tecnica Surface Plasmon Resonance (SPR) utilizzando uno strumento BIACORE 3000. Sebbene diversi esperimenti siano stati già condotti, occorrono tuttavia ulteriori prove per arrivare a chiarire il quadro completo di questa complessa rete d’interazioni

Effect of the addition of a non-ionic surfactant on the complex poly(asparagine)-cationic surfactant

Poly(asparagine) (pAsn) at 0.1wt % in the presence of dodecyltrimethylammonium bromide (DTAB) and pentaoxyethylene octyl ether (C8E5) at 1:1 molar ratio leads to the formation of mixed DTAB/C8E5 micelle-like aggregates onto the polypeptide as a total surfactant critical association concentration (cac) is reached, as revealed by surface tension measurements and NMR chemical shifts. Two-dimensional nuclear Overhauser enhancement spectroscopy (NOESY) capable of revealing spatial relationships among proximal protons has been performed on the pAsn-DTAB-C8E5-water system to study structural details of the surfactant-polypeptide aggregates. NOESY cross-peaks at sample temperature of 298.15 K indicate that the polypeptide interacts with the DTAB/C8E5 micelle-like aggregates. The NOE intermolecular effects also show direct interactions between surfactant and polypeptide in the pAsn-DTAB-water system, whereas no interaction has been revealed in the pAsn-C8E5-water system. Furthermore, the experimental evidence suggest that the DTAB-polypeptide complex is mainly driven by the polar attraction between the two molecule