Einfluss der Organtemperatur auf den mikrovaskulären Ischämie-Reperfusionsschaden der Leber

Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss der Organtemperatur während der Ischämie auf den mikrovaskulären Ischämie-Reperfusionsschaden systematisch zu analysieren. Um dies zu ermöglichen wurde im ersten Abschnitt der vorliegenden Arbeit ein geeignetes Tiermodell etabliert. Das entwickelte Modell ermöglichte eine reversible in situ Ischämie mit anschliessender Reperfusion des linken Leberlappens der Maus. Während der Ischämie konnte der ischämische Leberlappen genau auf die gewünschte Temperatur eingestellt und konstant gehalten werden. Abgesehen von der unterschiedlich eingestellten Organtemperatur, herrschten bei allen Versuchsgruppen gleiche Bedingungen. Weder bei der Körperkerntemperatur noch bei dem mittleren arteriellen Blutdruck gab es signifikante Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen. Nach darauffolgender Reperfusion ermöglichte das Modell eine intravitalmikroskopische Analyse der Mikrozirkulation und anschliessende ex vivo Messungen vieler Schadensparameter. Damit ist es gelungen, ein geeignetes Tiermodell zur systematischen in vivo Analyse des singulären Einflusses verschiedener Organtemperaturen auf den hepatischen Ischämie-Reperfusionsschaden der Maus, zu etablieren. Die Ergebnisse wiesen, in Übereinstimmung mit der Literatur, einen ausgeprägten Ischämie-Reperfusionsschaden nach normothermer Ischämie auf. Dabei war die sinusoidale Perfusionsrate signifikant reduziert, es trat eine deutliche Zunahme der Leukozyten-Endothelzell-Interaktion auf und es folgte eine massive Freisetzung der Leberenzyme AST/GOT und ALT/GPT. Erstaunlicherweise konnten bereits durch eine milde Hypothermie von 26°C sämtliche Schadensparameter auf das Niveau der Shamgruppe reduziert werden. Entgegen der Erwartung scheint es keinen linearen Zusammenhang zwischen Organtemperatur und Ausmaß des mikrovaskulären Schadens zu geben. Vergleichbar mit den Ergebnissen der Mikrozirkulation war nach normothermer Ischämie auch eine Vielzahl apoptotischer Zellen zu verzeichnen. Nahezu 17% der Hepatozyten waren TUNEL-positiv und die Aktivität der apoptose-spezifischen Caspase-3 nahm um etwa das vierfache zu. Auch hier bewirkte bereits ein mildes Abkühlen des ischämischen Leberlappens auf 31,5°C eine vollständige Protektion der Leberzellen vor Apoptose. Es zeigte sich damit auch hier kein linearer Zusammenhang zwischen Organtemperatur und Ausmaß einer Apoptoseinduktion. Der Verdacht auf eine durch Kälte induzierte Apoptose konnte sich in diesem Versuchsaufbau nicht erhärten. Nach 90-minütiger Ischämie bei 4°C waren, wie auch in der Shamgruppe, weniger als 1% TUNEL-positive Zellen zu verzeichnen und ein Anstieg der Caspase-3-Aktivität blieb vollständig aus. Bei der Betrachtung, ob es sich bei der Zellschädigung um nekrotischen oder um apoptotischen Zelltod handelt, ergaben die verwendeten Messmethoden deutliche Hinweise für beide Arten des Zelltodes

Einfluss der Organtemperatur auf den mikrovaskulären Ischämie-Reperfusionsschaden der Leber

Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss der Organtemperatur während der Ischämie auf den mikrovaskulären Ischämie-Reperfusionsschaden systematisch zu analysieren. Um dies zu ermöglichen wurde im ersten Abschnitt der vorliegenden Arbeit ein geeignetes Tiermodell etabliert. Das entwickelte Modell ermöglichte eine reversible in situ Ischämie mit anschliessender Reperfusion des linken Leberlappens der Maus. Während der Ischämie konnte der ischämische Leberlappen genau auf die gewünschte Temperatur eingestellt und konstant gehalten werden. Abgesehen von der unterschiedlich eingestellten Organtemperatur, herrschten bei allen Versuchsgruppen gleiche Bedingungen. Weder bei der Körperkerntemperatur noch bei dem mittleren arteriellen Blutdruck gab es signifikante Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen. Nach darauffolgender Reperfusion ermöglichte das Modell eine intravitalmikroskopische Analyse der Mikrozirkulation und anschliessende ex vivo Messungen vieler Schadensparameter. Damit ist es gelungen, ein geeignetes Tiermodell zur systematischen in vivo Analyse des singulären Einflusses verschiedener Organtemperaturen auf den hepatischen Ischämie-Reperfusionsschaden der Maus, zu etablieren. Die Ergebnisse wiesen, in Übereinstimmung mit der Literatur, einen ausgeprägten Ischämie-Reperfusionsschaden nach normothermer Ischämie auf. Dabei war die sinusoidale Perfusionsrate signifikant reduziert, es trat eine deutliche Zunahme der Leukozyten-Endothelzell-Interaktion auf und es folgte eine massive Freisetzung der Leberenzyme AST/GOT und ALT/GPT. Erstaunlicherweise konnten bereits durch eine milde Hypothermie von 26°C sämtliche Schadensparameter auf das Niveau der Shamgruppe reduziert werden. Entgegen der Erwartung scheint es keinen linearen Zusammenhang zwischen Organtemperatur und Ausmaß des mikrovaskulären Schadens zu geben. Vergleichbar mit den Ergebnissen der Mikrozirkulation war nach normothermer Ischämie auch eine Vielzahl apoptotischer Zellen zu verzeichnen. Nahezu 17% der Hepatozyten waren TUNEL-positiv und die Aktivität der apoptose-spezifischen Caspase-3 nahm um etwa das vierfache zu. Auch hier bewirkte bereits ein mildes Abkühlen des ischämischen Leberlappens auf 31,5°C eine vollständige Protektion der Leberzellen vor Apoptose. Es zeigte sich damit auch hier kein linearer Zusammenhang zwischen Organtemperatur und Ausmaß einer Apoptoseinduktion. Der Verdacht auf eine durch Kälte induzierte Apoptose konnte sich in diesem Versuchsaufbau nicht erhärten. Nach 90-minütiger Ischämie bei 4°C waren, wie auch in der Shamgruppe, weniger als 1% TUNEL-positive Zellen zu verzeichnen und ein Anstieg der Caspase-3-Aktivität blieb vollständig aus. Bei der Betrachtung, ob es sich bei der Zellschädigung um nekrotischen oder um apoptotischen Zelltod handelt, ergaben die verwendeten Messmethoden deutliche Hinweise für beide Arten des Zelltodes

miR-124a and miR-155 enhance differentiation of regulatory T cells in patients with neuropathic pain

Background: Accumulating evidence indicates that neuropathic pain is a neuro-immune disorder with enhanced activation of the immune system. Recent data provided proof that neuropathic pain patients exhibit increased numbers of immunosuppressive regulatory T cells (Tregs), which may represent an endogenous attempt to limit inflammation and to reduce pain levels. We here investigate the molecular mechanisms underlying these alterations. Methods: Our experimental approach includes functional analyses of primary human T cells, 3'-UTR reporter assays, and expression analyses of neuropathic pain patients' samples. Results: We demonstrate that microRNAs (miRNAs) are involved in the differentiation of Tregs in neuropathic pain. We identify miR-124a and miR-155 as direct repressors of the histone deacetylase sirtuin1 (SIRT1) in primary human CD4+ cells. Targeting of SIRT1 by either specific siRNA or by these two miRNAs results in an increase of Foxp3 expression and, consecutively, of anti-inflammatory Tregs (siRNA: 1.7 +/- 0.4;miR-124a: 1.5 +/- 0.4;miR-155: 1.6 +/- 0.4;p < 0.01). As compared to healthy volunteers, neuropathic pain patients exhibited an increased expression of miR124a (2.5 +/- 0.7, p < 0.05) and miR-155 (1.3 +/- 0.3;p < 0.05) as well as a reduced expression of SIRT1 (0.5 +/- 0.2;p < 0.01). Moreover, the expression of these two miRNAs was inversely correlated with SIRT1 transcript levels. Conclusions: Our findings suggest that in neuropathic pain, enhanced targeting of SIRT1 by miR-124a and miR-155 induces a bias of CD4(+) T cell differentiation towards Tregs, thereby limiting pain-evoking inflammation. Deciphering miRNA-target interactions that influence inflammatory pathways in neuropathic pain may contribute to the discovery of new roads towards pain amelioration

miR-124a and miR-155 enhance differentiation of regulatory T cells in patients with neuropathic pain

Background: Accumulating evidence indicates that neuropathic pain is a neuro-immune disorder with enhanced activation of the immune system. Recent data provided proof that neuropathic pain patients exhibit increased numbers of immunosuppressive regulatory T cells (Tregs), which may represent an endogenous attempt to limit inflammation and to reduce pain levels. We here investigate the molecular mechanisms underlying these alterations. Methods: Our experimental approach includes functional analyses of primary human T cells, 3'-UTR reporter assays, and expression analyses of neuropathic pain patients' samples. Results: We demonstrate that microRNAs (miRNAs) are involved in the differentiation of Tregs in neuropathic pain. We identify miR-124a and miR-155 as direct repressors of the histone deacetylase sirtuin1 (SIRT1) in primary human CD4+ cells. Targeting of SIRT1 by either specific siRNA or by these two miRNAs results in an increase of Foxp3 expression and, consecutively, of anti-inflammatory Tregs (siRNA: 1.7 +/- 0.4;miR-124a: 1.5 +/- 0.4;miR-155: 1.6 +/- 0.4;p < 0.01). As compared to healthy volunteers, neuropathic pain patients exhibited an increased expression of miR124a (2.5 +/- 0.7, p < 0.05) and miR-155 (1.3 +/- 0.3;p < 0.05) as well as a reduced expression of SIRT1 (0.5 +/- 0.2;p < 0.01). Moreover, the expression of these two miRNAs was inversely correlated with SIRT1 transcript levels. Conclusions: Our findings suggest that in neuropathic pain, enhanced targeting of SIRT1 by miR-124a and miR-155 induces a bias of CD4(+) T cell differentiation towards Tregs, thereby limiting pain-evoking inflammation. Deciphering miRNA-target interactions that influence inflammatory pathways in neuropathic pain may contribute to the discovery of new roads towards pain amelioration

Anti-inflammatory T-cell shift in neuropathic pain

Background: The classification of pain into nociceptive and neuropathic pain is based on characteristic symptoms and different pathophysiological mechanisms. In a recent investigation, we found a disrupted TH17/Treg balance in patients suffering from chronic unspecific low back pain (CLBP). These patients did not show any signs of neuropathy. There is evidence for a considerable impact of the immune system also in neuropathic pain. However, the role of the adaptive immune system is still unclear. In the present study, we investigated systemic T-cell subset responses and T-cell related cytokine profiles in patients with chronic neuropathic pain. Methods: We analyzed T-cell subsets, mRNA expression and T-cell-related cytokine profiles in 26 patients suffering from neuropathic pain in comparison to 26 healthy controls. Using multicolor flow cytometry (FACS), we quantified the number of T helper cells 1 (TH1), TH2, TH17 and regulatory T-cells (Tregs). Forkhead-Box-Protein 3 (FoxP3), Transforming growth factor-beta (TGF-beta) and RAR-related orphan receptor-gamma T (ROR-gamma T) mRNA expression was determined by quantitative real-time PCR (qPCR) and levels of pain-related cytokines were measured by Human Cytokine Multiplex Immunoassay (Macrophage inflammatory protein-1 alpha (MIP-1 alpha), Tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha), Interferon-gamma (IFN-gamma), Interleukin (IL) -4, IL-6, IL-10, IL-17, and IL-23). Results: We found a TH17/Treg imbalance with significantly increased anti-inflammatory Tregs and decreased pro-inflammatory TH17 cells in patients with neuropathic pain as compared to healthy controls. These results were confirmed on mRNA level: Treg-related FoxP3 and TGF-beta mRNA expression was elevated, whereas expression of TH17-related ROR gamma T was reduced. Cytokine analyses revealed only marginal changes. Conclusions: Our investigation revealed a clear shift of T-cell subsets towards anti-inflammation in patients with neuropathic pain. Interestingly, this is quite similar to our previous findings in CLBP patients, but even more pronounced. Therefore, it remains to be elucidated in future investigations whether the immune changes represent an underlying pathophysiological mechanism or an epiphenomenon induced by ongoing pain and stress

Differential expression of P2X7 receptor and IL-1 beta in nociceptive and neuropathic pain

Background: Despite substantial progress, pathogenesis and therapy of chronic pain are still the focus of many investigations. The ATP-gated P2X7 receptor (P2X7R) has previously been shown to play a central role in animal models of nociceptive inflammatory and neuropathic pain. Recently, we found that the adaptive immune system is involved in the pathophysiology of chronic nociceptive and neuropathic pain in humans. So far, data regarding P2X7R expression patterns on cells of the adaptive immune system of pain patients are scarce. We therefore analyzed the P2X7R expression on peripheral blood lymphocytes and monocytes, as well as serum levels of IL-1 beta in patients suffering from chronic nociceptive and neuropathic pain in comparison to healthy volunteers in order to identify individuals who might benefit from a P2X7R modulating therapy. Methods: P2X7R messenger RNA (mRNA) and protein expression were determined in patients with either chronic nociceptive low back pain (CLBP) or neuropathic pain (NeP), and in healthy volunteers by quantitative real-time PCR (qPCR) and by fluorescence-assisted cell-sorting (FACS), respectively. IL-1 beta serum levels were measured with a multiplex cytokine assay. Results: Compared to healthy volunteers, P2X7R mRNA (1.6-fold, p = 0.038) and protein levels were significantly increased on monocytes (NeP: 24.6 +/- 6.2, healthy volunteers: 17.0 +/- 5.4;p = 0.002) and lymphocytes (NeP: 21.8 +/- 6.5, healthy volunteers: 15.6 +/- 5.2;p = 0.009) of patients with NeP, but not in patients with CLBP. Similarly, IL-1 beta serum concentrations were significantly elevated only in NeP patients (1.4-fold, p = 0.04). Conclusions: A significant upregulation of P2X7R and increased IL-1 beta release seems to be a particular phenomenon in patients with NeP. P2X7R inhibitors may therefore represent a potential option for the treatment of this frequently intractable type of pain