Characterisation of enzymatic reactions in coacervate-based synthetic cells

Recently, there has been a growing drive towards the bottom-up development of synthetic cells that mimic key cellular features. A cellular feature ubiquitous amongst cells is that of compartmentalisation. Compartmentalisation enables the spatiotemporal control of biochemical reactions and is thus vital for the development of synthetic cells. To date, most synthetic cell models have utilised classical membrane bound containers as model compartments. However, recent advances in cell biology have highlighted the importance of membraneless compartments formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) as organisation centres. It has been suggested that these organelles play a critical role in regulating cell biochemistry, yet very little is known about their interactions with enzymatic reactions. Thus, aiming to develop novel synthetic capabilities, the work presented in this thesis designs and characterises synthetic cells which include features of membraneless compartmentalisation. These systems utilise complex coacervates, a specific type of LLPS that is driven by the electrostatic attraction of oppositely charged polymers, as model membraneless compartments. These low complexity systems subsequently provide ideal platforms for systematic investigations of the interaction of membraneless coacervate compartments with enzymatic reactions. In Chapter 3 and 4, I focus on developing a responsive synthetic cell system that recapitulates features of membrane-bound and membraneless compartmentalisation. I generate a pH-responsive system by exploiting the intrinsic pKa of cationic polylysine to trigger coacervation within a liposome. This synthetic cell is then functionalised with the enzyme formate dehydrogenase (FDH). I show that coacervate properties can be utilized to locally concentrate and activate the FDH reaction at low enzyme concentrations, thus demonstrating that membraneless compartments can activate reactions via sequestration into coacervate reaction centres. In Chapter 5, I then proceed to characterise whether the diffusive exchange of molecules across a droplet phase boundary effects enzyme dynamics. Synthetic cells constructed from emulsion droplets with coacervate sub-compartments were used as model systems with diffusive exchange, while bulk coacervate and supernatant phases were used as uncoupled model systems without exchange. I studied the FDH reaction in both models and I conclude that coupling of the phases increases reaction rates compared to an uncoupled system. When coupled, the supernatant acts as a ’sink’ removing the product NADH from the coacervate droplets. This increases the apparent reaction rate in the supernatant, while the reduction of NADH concentration in the coacervate reduces product inhibition. This demonstrated that the open phase boundary tightly couples membraneless droplets to their surroundings, which can ultimately lead to increased reaction rates both inside and outside the compartments. Finally in Chapter 6, I scrutinize enzyme kinetics of the enzymes FDH and β -galactosidase in the unique coacervate physicochemical environment using Michaelis-Menten assays in CM-Dex/PDDA bulk phase. Results show that the KM and Vmax of FDH significantly increased compared to buffer, while those of β-galactosidase do not. I hypothesise that the negatively charged formate substrate of the FDH reaction interacts strongly with the positively charged PDDA, decreasing its affinity for the enzyme. Furthermore, I suggest that the coacervate environment facilitates the rate limiting hydride transfer of the reaction, thereby increasing the maximum rate. This data demonstrates that the coacervate environment itself can tune and control enzyme dynamics. In conclusion, my work establishes responsive, tunable and enzymatically active syn- thetic cellular systems with features of membraneless compartmentalisation. My results indicate that membraneless compartments can have significant impact on the dynamics of enzymatic reactions, opening up possible ways to control reaction rates in synthetic systems and suggesting plausible functions for membraneless organelles in vivo. Overall, I demonstrate that rationally designed synthetic cells provide biomimetic experimental platforms that offer insights into the influence of membraneless compartmentalisation on enzymatic reactions. Parts of the presented work have been published as two first author publications in peer-reviewed journals.‘Bottom-up'’ Modelle synthetischer Zellen, die Schlüsselmerkmale zellbasierten Lebens imitieren, rücken immer mehr in den Fokus. Von zentraler Bedeutung ist hier die Kompartmentbildung. Sie erst ermöglicht die räumliche und zeitliche Kontrolle biochemischer Abläufe und ist daher entscheidend bei der Entwicklung synthetischer Zellen. Bisher wurden in der Mehrzahl der synthetischen Zellmodelle klassische, membrangebundene Reaktionsräume als Modellkompartimente verwendet. Jüngste Fortschritte in der Zellbiologie belegen jedoch die Bedeutung von membranlosen Kompartimenten, die durch Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) gebildet werden. Es wird angenommen, dass diese membranlosen Kompartimente eine zentrale Rolle bei der Regulierung der Zellchemie spielen. Jedoch ist bisher nur sehr wenig über ihren Einfluss auf enzymatische Reaktionen bekannt und experimentell belegt. Mit dem Ziel, die Bandbreite und das Verständnis synthetischer Modelle zu erweitern, wurden in dieser Arbeit neue Methoden entwickelt und dargestellt, die membranlose Kompartmentbildung benutzen. Es wurden hierfür komplexe Koazervate eingesetzt, eine spezielle Art der LLPS, welche durch die elektrostatische Anziehung von entgegengesetzt geladenen Polymeren angetrieben wird. Diese verhältnismäßig einfachen Systeme bieten eine ideale Plattform für systematische Untersuchungen des Einflusses von membranlosen Koazervatkompartimenten auf enzymatische Reaktionen. In den Kapiteln 3 und 4 konzentrierte ich mich auf die Entwicklung eines reaktionsfähigen synthetischen Modellsystems, das die Phänomene sowohl membrangebundener als auch membranfreier Kompartmentbildung vereint. Zur Steuerung der Koazervierung innerhalb von Liposomen wurde ein pH-reaktives System verwendet, welches sich den intrinsischen pKa von kationischen Polylysin zunutze macht. Diese synthetis- che Zelle wurde im folgenden Schritt mit dem Enzym Formiat-Dehydrogenase (FDH) funktionalisiert. Ich konnte damit zeigen, dass es die Eigenschaften von Koazervaten ermöglichen, die FDH-Reaktion bei global sehr niedrigen Enzymkonzentrationen zu aktivieren. Hierbei wirken die membranlosen Koazervate in Folge einer lokal er- höhten Enzymkonzentration als Zentren gesteigerter Reaktivität. Dies geschieht durch die lokale Konzentrationserhöhung in Koazervaten, was bei LLPS auch durch den Verteilungskoeffizient beschrieben wird. Mit anderen Worten agieren diese membran- losen Kompartimente durch Sequestrierung als Reaktionszentren. Im Kapitel 5 charakterisierte ich den Einfluss von diffusivem Molekülaustausch auf die Enzymkinetik über die Koazervat-Phasengrenze hinweg. Hierbei wurden zwei Systeme miteinander verglichen. Einerseits wurde ein synthetisches Zellmodell, beste- hend aus mikrofluidisch hergestellten Wasser-in-Öl Emulsionstropfen, die Koazervate enthalten, als Modellsystem mit diffusivem Austausch zwischen den Phasen verwendet. Andererseits wurden separate, reine Koazervatphasen und reine Überstandsphasen als Modellsysteme ohne Austausch verwendet. Ich habe die FDH-Reaktion in beiden Modellsystemen untersucht und kam zu dem Schluss, dass die Kopplung der Phasen die Reaktionsgeschwindigkeiten im Vergleich zu den ungekoppelten Systemen erhöht. Bei der Kopplung wirkt die Überstandsphase als Senke, die das Produkt NADH aus den Koazervaten aufnimmt. Dies erhöht die scheinbare Reaktionsgeschwindigkeit im Überstand, während die Verringerung der NADH-Konzentration im Koazervat die Produkthemmung verringert. Dies zeigt, dass die offene Phasengrenze membranloser Kompartimente eng mit ihrer Umgebung gekoppelt ist, was als erhöhte Reaktionsraten sowohl innerhalb als auch außerhalb der Kompartimente gemessen werden kann. Schließlich untersuchte ich in Kapitel 6 die Enzymkinetik der Enzyme FDH und β- Galaktosidase in der physikalisch-chemischen Umgebung des Koazervats. Mit Hilfe von Michaelis-Menten-Experimenten in der CM-Dextran/PDDA-Bulkphase konnte gezeigt werden, dass KM und Vmax von FDH im Vergleich zum Überstand signifikant erhöht sind, wohingegen jene von β-Galaktosidase ein solches Verhalten nicht zeigen. Das führte mich zu der Hypothese, dass das negativ geladene Formiatsubstrat der FDH- Reaktion stark mit dem positiv geladenen PDDA interagiert, wodurch seine Affinität für das Enzym abnimmt. Darüber hinaus wird der ratenbegrenzende Hydridtransfer in der Umgebung des Koazervats erleichtert und es kann eine Erhöhung der Reaktionsrate beobachtet werden. Die Daten zeigen, dass abhängig vom Koazervat-Milieu die Enzymdynamik in verschiedene Richtungen gesteuert werden kann. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass meine Arbeit reaktionsfähige, steuerbare und enzymatisch aktive synthetische Zellsysteme mit Eigenschaften membranloser Kompartmentbildung etabliert. Meine Ergebnisse deuten darauf hin, dass membranlose Kompartimente einen signifikanten Einfluss auf die Dynamik enzymatischer Reaktio- nen haben. Meine Untersuchungen eröffnen damit neuartige Wege zur Kontrolle der Reaktionsgeschwindigkeit in synthetischen Systemen und erweitern das Verständnis möglicher Funktionen membranloser Organellen in vivo. Insgesamt zeige ich, dass über- legt entworfene synthetische Zellen eine hervorragende biomimetische Plattform bieten, um Einblicke in den Einfluss von membranloser Kompartimentierung auf enzymatische Reaktionen zu gewinnen. Teile der vorgestellten Arbeit wurden als wissenschaftliche Beiträge in zwei begutachteten Journalen als Erstautor veröffentlicht

Quantitative theory for the diffusive dynamics of liquid condensates

Key processes of biological condensates are diffusion and material exchange with their environment. Experimentally, diffusive dynamics are typically probed via fluorescent labels. However, to date, a physics-based, quantitative framework for the dynamics of labeled condensate components is lacking. Here, we derive the corresponding dynamic equations, building on the physics of phase separation, and quantitatively validate the related framework via experiments. We show that by using our framework, we can precisely determine diffusion coefficients inside liquid condensates via a spatio-temporal analysis of fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments. We showcase the accuracy and precision of our approach by considering space- and time-resolved data of protein condensates and two different polyelectrolyte-coacervate systems. Interestingly, our theory can also be used to determine a relationship between the diffusion coefficient in the dilute phase and the partition coefficient, without relying on fluorescence measurements in the dilute phase. This enables us to investigate the effect of salt addition on partitioning and bypasses recently described quenching artifacts in the dense phase. Our approach opens new avenues for theoretically describing molecule dynamics in condensates, measuring concentrations based on the dynamics of fluorescence intensities, and quantifying rates of biochemical reactions in liquid condensates

Molecular engineering improves antigen quality and enables integrated manufacturing of a trivalent subunit vaccine candidate for rotavirus

Background Vaccines comprising recombinant subunit proteins are well-suited to low-cost and high-volume production for global use. The design of manufacturing processes to produce subunit vaccines depends, however, on the inherent biophysical traits presented by an individual antigen of interest. New candidate antigens typically require developing custom processes for each one and may require unique steps to ensure sufficient yields without product-related variants. Results We describe a holistic approach for the molecular design of recombinant protein antigens—considering both their manufacturability and antigenicity—informed by bioinformatic analyses such as RNA-seq, ribosome profiling, and sequence-based prediction tools. We demonstrate this approach by engineering the product sequences of a trivalent non-replicating rotavirus vaccine (NRRV) candidate to improve titers and mitigate product variants caused by N-terminal truncation, hypermannosylation, and aggregation. The three engineered NRRV antigens retained their original antigenicity and immunogenicity, while their improved manufacturability enabled concomitant production and purification of all three serotypes in a single, end-to-end perfusion-based process using the biotechnical yeast Komagataella phaffii. Conclusions This study demonstrates that molecular engineering of subunit antigens using advanced genomic methods can facilitate their manufacturing in continuous production. Such capabilities have potential to lower the cost and volumetric requirements in manufacturing vaccines based on recombinant protein subunits

Characterisation of enzymatic reactions in coacervate-based synthetic cells

Recently, there has been a growing drive towards the bottom-up development of synthetic cells that mimic key cellular features. A cellular feature ubiquitous amongst cells is that of compartmentalisation. Compartmentalisation enables the spatiotemporal control of biochemical reactions and is thus vital for the development of synthetic cells. To date, most synthetic cell models have utilised classical membrane bound containers as model compartments. However, recent advances in cell biology have highlighted the importance of membraneless compartments formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) as organisation centres. It has been suggested that these organelles play a critical role in regulating cell biochemistry, yet very little is known about their interactions with enzymatic reactions. Thus, aiming to develop novel synthetic capabilities, the work presented in this thesis designs and characterises synthetic cells which include features of membraneless compartmentalisation. These systems utilise complex coacervates, a specific type of LLPS that is driven by the electrostatic attraction of oppositely charged polymers, as model membraneless compartments. These low complexity systems subsequently provide ideal platforms for systematic investigations of the interaction of membraneless coacervate compartments with enzymatic reactions. In Chapter 3 and 4, I focus on developing a responsive synthetic cell system that recapitulates features of membrane-bound and membraneless compartmentalisation. I generate a pH-responsive system by exploiting the intrinsic pKa of cationic polylysine to trigger coacervation within a liposome. This synthetic cell is then functionalised with the enzyme formate dehydrogenase (FDH). I show that coacervate properties can be utilized to locally concentrate and activate the FDH reaction at low enzyme concentrations, thus demonstrating that membraneless compartments can activate reactions via sequestration into coacervate reaction centres. In Chapter 5, I then proceed to characterise whether the diffusive exchange of molecules across a droplet phase boundary effects enzyme dynamics. Synthetic cells constructed from emulsion droplets with coacervate sub-compartments were used as model systems with diffusive exchange, while bulk coacervate and supernatant phases were used as uncoupled model systems without exchange. I studied the FDH reaction in both models and I conclude that coupling of the phases increases reaction rates compared to an uncoupled system. When coupled, the supernatant acts as a ’sink’ removing the product NADH from the coacervate droplets. This increases the apparent reaction rate in the supernatant, while the reduction of NADH concentration in the coacervate reduces product inhibition. This demonstrated that the open phase boundary tightly couples membraneless droplets to their surroundings, which can ultimately lead to increased reaction rates both inside and outside the compartments. Finally in Chapter 6, I scrutinize enzyme kinetics of the enzymes FDH and β -galactosidase in the unique coacervate physicochemical environment using Michaelis-Menten assays in CM-Dex/PDDA bulk phase. Results show that the KM and Vmax of FDH significantly increased compared to buffer, while those of β-galactosidase do not. I hypothesise that the negatively charged formate substrate of the FDH reaction interacts strongly with the positively charged PDDA, decreasing its affinity for the enzyme. Furthermore, I suggest that the coacervate environment facilitates the rate limiting hydride transfer of the reaction, thereby increasing the maximum rate. This data demonstrates that the coacervate environment itself can tune and control enzyme dynamics. In conclusion, my work establishes responsive, tunable and enzymatically active syn- thetic cellular systems with features of membraneless compartmentalisation. My results indicate that membraneless compartments can have significant impact on the dynamics of enzymatic reactions, opening up possible ways to control reaction rates in synthetic systems and suggesting plausible functions for membraneless organelles in vivo. Overall, I demonstrate that rationally designed synthetic cells provide biomimetic experimental platforms that offer insights into the influence of membraneless compartmentalisation on enzymatic reactions. Parts of the presented work have been published as two first author publications in peer-reviewed journals.‘Bottom-up'’ Modelle synthetischer Zellen, die Schlüsselmerkmale zellbasierten Lebens imitieren, rücken immer mehr in den Fokus. Von zentraler Bedeutung ist hier die Kompartmentbildung. Sie erst ermöglicht die räumliche und zeitliche Kontrolle biochemischer Abläufe und ist daher entscheidend bei der Entwicklung synthetischer Zellen. Bisher wurden in der Mehrzahl der synthetischen Zellmodelle klassische, membrangebundene Reaktionsräume als Modellkompartimente verwendet. Jüngste Fortschritte in der Zellbiologie belegen jedoch die Bedeutung von membranlosen Kompartimenten, die durch Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) gebildet werden. Es wird angenommen, dass diese membranlosen Kompartimente eine zentrale Rolle bei der Regulierung der Zellchemie spielen. Jedoch ist bisher nur sehr wenig über ihren Einfluss auf enzymatische Reaktionen bekannt und experimentell belegt. Mit dem Ziel, die Bandbreite und das Verständnis synthetischer Modelle zu erweitern, wurden in dieser Arbeit neue Methoden entwickelt und dargestellt, die membranlose Kompartmentbildung benutzen. Es wurden hierfür komplexe Koazervate eingesetzt, eine spezielle Art der LLPS, welche durch die elektrostatische Anziehung von entgegengesetzt geladenen Polymeren angetrieben wird. Diese verhältnismäßig einfachen Systeme bieten eine ideale Plattform für systematische Untersuchungen des Einflusses von membranlosen Koazervatkompartimenten auf enzymatische Reaktionen. In den Kapiteln 3 und 4 konzentrierte ich mich auf die Entwicklung eines reaktionsfähigen synthetischen Modellsystems, das die Phänomene sowohl membrangebundener als auch membranfreier Kompartmentbildung vereint. Zur Steuerung der Koazervierung innerhalb von Liposomen wurde ein pH-reaktives System verwendet, welches sich den intrinsischen pKa von kationischen Polylysin zunutze macht. Diese synthetis- che Zelle wurde im folgenden Schritt mit dem Enzym Formiat-Dehydrogenase (FDH) funktionalisiert. Ich konnte damit zeigen, dass es die Eigenschaften von Koazervaten ermöglichen, die FDH-Reaktion bei global sehr niedrigen Enzymkonzentrationen zu aktivieren. Hierbei wirken die membranlosen Koazervate in Folge einer lokal er- höhten Enzymkonzentration als Zentren gesteigerter Reaktivität. Dies geschieht durch die lokale Konzentrationserhöhung in Koazervaten, was bei LLPS auch durch den Verteilungskoeffizient beschrieben wird. Mit anderen Worten agieren diese membran- losen Kompartimente durch Sequestrierung als Reaktionszentren. Im Kapitel 5 charakterisierte ich den Einfluss von diffusivem Molekülaustausch auf die Enzymkinetik über die Koazervat-Phasengrenze hinweg. Hierbei wurden zwei Systeme miteinander verglichen. Einerseits wurde ein synthetisches Zellmodell, beste- hend aus mikrofluidisch hergestellten Wasser-in-Öl Emulsionstropfen, die Koazervate enthalten, als Modellsystem mit diffusivem Austausch zwischen den Phasen verwendet. Andererseits wurden separate, reine Koazervatphasen und reine Überstandsphasen als Modellsysteme ohne Austausch verwendet. Ich habe die FDH-Reaktion in beiden Modellsystemen untersucht und kam zu dem Schluss, dass die Kopplung der Phasen die Reaktionsgeschwindigkeiten im Vergleich zu den ungekoppelten Systemen erhöht. Bei der Kopplung wirkt die Überstandsphase als Senke, die das Produkt NADH aus den Koazervaten aufnimmt. Dies erhöht die scheinbare Reaktionsgeschwindigkeit im Überstand, während die Verringerung der NADH-Konzentration im Koazervat die Produkthemmung verringert. Dies zeigt, dass die offene Phasengrenze membranloser Kompartimente eng mit ihrer Umgebung gekoppelt ist, was als erhöhte Reaktionsraten sowohl innerhalb als auch außerhalb der Kompartimente gemessen werden kann. Schließlich untersuchte ich in Kapitel 6 die Enzymkinetik der Enzyme FDH und β- Galaktosidase in der physikalisch-chemischen Umgebung des Koazervats. Mit Hilfe von Michaelis-Menten-Experimenten in der CM-Dextran/PDDA-Bulkphase konnte gezeigt werden, dass KM und Vmax von FDH im Vergleich zum Überstand signifikant erhöht sind, wohingegen jene von β-Galaktosidase ein solches Verhalten nicht zeigen. Das führte mich zu der Hypothese, dass das negativ geladene Formiatsubstrat der FDH- Reaktion stark mit dem positiv geladenen PDDA interagiert, wodurch seine Affinität für das Enzym abnimmt. Darüber hinaus wird der ratenbegrenzende Hydridtransfer in der Umgebung des Koazervats erleichtert und es kann eine Erhöhung der Reaktionsrate beobachtet werden. Die Daten zeigen, dass abhängig vom Koazervat-Milieu die Enzymdynamik in verschiedene Richtungen gesteuert werden kann. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass meine Arbeit reaktionsfähige, steuerbare und enzymatisch aktive synthetische Zellsysteme mit Eigenschaften membranloser Kompartmentbildung etabliert. Meine Ergebnisse deuten darauf hin, dass membranlose Kompartimente einen signifikanten Einfluss auf die Dynamik enzymatischer Reaktio- nen haben. Meine Untersuchungen eröffnen damit neuartige Wege zur Kontrolle der Reaktionsgeschwindigkeit in synthetischen Systemen und erweitern das Verständnis möglicher Funktionen membranloser Organellen in vivo. Insgesamt zeige ich, dass über- legt entworfene synthetische Zellen eine hervorragende biomimetische Plattform bieten, um Einblicke in den Einfluss von membranloser Kompartimentierung auf enzymatische Reaktionen zu gewinnen. Teile der vorgestellten Arbeit wurden als wissenschaftliche Beiträge in zwei begutachteten Journalen als Erstautor veröffentlicht

Characterisation of enzymatic reactions in coacervate-based synthetic cells

Recently, there has been a growing drive towards the bottom-up development of synthetic cells that mimic key cellular features. A cellular feature ubiquitous amongst cells is that of compartmentalisation. Compartmentalisation enables the spatiotemporal control of biochemical reactions and is thus vital for the development of synthetic cells. To date, most synthetic cell models have utilised classical membrane bound containers as model compartments. However, recent advances in cell biology have highlighted the importance of membraneless compartments formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) as organisation centres. It has been suggested that these organelles play a critical role in regulating cell biochemistry, yet very little is known about their interactions with enzymatic reactions. Thus, aiming to develop novel synthetic capabilities, the work presented in this thesis designs and characterises synthetic cells which include features of membraneless compartmentalisation. These systems utilise complex coacervates, a specific type of LLPS that is driven by the electrostatic attraction of oppositely charged polymers, as model membraneless compartments. These low complexity systems subsequently provide ideal platforms for systematic investigations of the interaction of membraneless coacervate compartments with enzymatic reactions. In Chapter 3 and 4, I focus on developing a responsive synthetic cell system that recapitulates features of membrane-bound and membraneless compartmentalisation. I generate a pH-responsive system by exploiting the intrinsic pKa of cationic polylysine to trigger coacervation within a liposome. This synthetic cell is then functionalised with the enzyme formate dehydrogenase (FDH). I show that coacervate properties can be utilized to locally concentrate and activate the FDH reaction at low enzyme concentrations, thus demonstrating that membraneless compartments can activate reactions via sequestration into coacervate reaction centres. In Chapter 5, I then proceed to characterise whether the diffusive exchange of molecules across a droplet phase boundary effects enzyme dynamics. Synthetic cells constructed from emulsion droplets with coacervate sub-compartments were used as model systems with diffusive exchange, while bulk coacervate and supernatant phases were used as uncoupled model systems without exchange. I studied the FDH reaction in both models and I conclude that coupling of the phases increases reaction rates compared to an uncoupled system. When coupled, the supernatant acts as a ’sink’ removing the product NADH from the coacervate droplets. This increases the apparent reaction rate in the supernatant, while the reduction of NADH concentration in the coacervate reduces product inhibition. This demonstrated that the open phase boundary tightly couples membraneless droplets to their surroundings, which can ultimately lead to increased reaction rates both inside and outside the compartments. Finally in Chapter 6, I scrutinize enzyme kinetics of the enzymes FDH and β -galactosidase in the unique coacervate physicochemical environment using Michaelis-Menten assays in CM-Dex/PDDA bulk phase. Results show that the KM and Vmax of FDH significantly increased compared to buffer, while those of β-galactosidase do not. I hypothesise that the negatively charged formate substrate of the FDH reaction interacts strongly with the positively charged PDDA, decreasing its affinity for the enzyme. Furthermore, I suggest that the coacervate environment facilitates the rate limiting hydride transfer of the reaction, thereby increasing the maximum rate. This data demonstrates that the coacervate environment itself can tune and control enzyme dynamics. In conclusion, my work establishes responsive, tunable and enzymatically active syn- thetic cellular systems with features of membraneless compartmentalisation. My results indicate that membraneless compartments can have significant impact on the dynamics of enzymatic reactions, opening up possible ways to control reaction rates in synthetic systems and suggesting plausible functions for membraneless organelles in vivo. Overall, I demonstrate that rationally designed synthetic cells provide biomimetic experimental platforms that offer insights into the influence of membraneless compartmentalisation on enzymatic reactions. Parts of the presented work have been published as two first author publications in peer-reviewed journals.‘Bottom-up'’ Modelle synthetischer Zellen, die Schlüsselmerkmale zellbasierten Lebens imitieren, rücken immer mehr in den Fokus. Von zentraler Bedeutung ist hier die Kompartmentbildung. Sie erst ermöglicht die räumliche und zeitliche Kontrolle biochemischer Abläufe und ist daher entscheidend bei der Entwicklung synthetischer Zellen. Bisher wurden in der Mehrzahl der synthetischen Zellmodelle klassische, membrangebundene Reaktionsräume als Modellkompartimente verwendet. Jüngste Fortschritte in der Zellbiologie belegen jedoch die Bedeutung von membranlosen Kompartimenten, die durch Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) gebildet werden. Es wird angenommen, dass diese membranlosen Kompartimente eine zentrale Rolle bei der Regulierung der Zellchemie spielen. Jedoch ist bisher nur sehr wenig über ihren Einfluss auf enzymatische Reaktionen bekannt und experimentell belegt. Mit dem Ziel, die Bandbreite und das Verständnis synthetischer Modelle zu erweitern, wurden in dieser Arbeit neue Methoden entwickelt und dargestellt, die membranlose Kompartmentbildung benutzen. Es wurden hierfür komplexe Koazervate eingesetzt, eine spezielle Art der LLPS, welche durch die elektrostatische Anziehung von entgegengesetzt geladenen Polymeren angetrieben wird. Diese verhältnismäßig einfachen Systeme bieten eine ideale Plattform für systematische Untersuchungen des Einflusses von membranlosen Koazervatkompartimenten auf enzymatische Reaktionen. In den Kapiteln 3 und 4 konzentrierte ich mich auf die Entwicklung eines reaktionsfähigen synthetischen Modellsystems, das die Phänomene sowohl membrangebundener als auch membranfreier Kompartmentbildung vereint. Zur Steuerung der Koazervierung innerhalb von Liposomen wurde ein pH-reaktives System verwendet, welches sich den intrinsischen pKa von kationischen Polylysin zunutze macht. Diese synthetis- che Zelle wurde im folgenden Schritt mit dem Enzym Formiat-Dehydrogenase (FDH) funktionalisiert. Ich konnte damit zeigen, dass es die Eigenschaften von Koazervaten ermöglichen, die FDH-Reaktion bei global sehr niedrigen Enzymkonzentrationen zu aktivieren. Hierbei wirken die membranlosen Koazervate in Folge einer lokal er- höhten Enzymkonzentration als Zentren gesteigerter Reaktivität. Dies geschieht durch die lokale Konzentrationserhöhung in Koazervaten, was bei LLPS auch durch den Verteilungskoeffizient beschrieben wird. Mit anderen Worten agieren diese membran- losen Kompartimente durch Sequestrierung als Reaktionszentren. Im Kapitel 5 charakterisierte ich den Einfluss von diffusivem Molekülaustausch auf die Enzymkinetik über die Koazervat-Phasengrenze hinweg. Hierbei wurden zwei Systeme miteinander verglichen. Einerseits wurde ein synthetisches Zellmodell, beste- hend aus mikrofluidisch hergestellten Wasser-in-Öl Emulsionstropfen, die Koazervate enthalten, als Modellsystem mit diffusivem Austausch zwischen den Phasen verwendet. Andererseits wurden separate, reine Koazervatphasen und reine Überstandsphasen als Modellsysteme ohne Austausch verwendet. Ich habe die FDH-Reaktion in beiden Modellsystemen untersucht und kam zu dem Schluss, dass die Kopplung der Phasen die Reaktionsgeschwindigkeiten im Vergleich zu den ungekoppelten Systemen erhöht. Bei der Kopplung wirkt die Überstandsphase als Senke, die das Produkt NADH aus den Koazervaten aufnimmt. Dies erhöht die scheinbare Reaktionsgeschwindigkeit im Überstand, während die Verringerung der NADH-Konzentration im Koazervat die Produkthemmung verringert. Dies zeigt, dass die offene Phasengrenze membranloser Kompartimente eng mit ihrer Umgebung gekoppelt ist, was als erhöhte Reaktionsraten sowohl innerhalb als auch außerhalb der Kompartimente gemessen werden kann. Schließlich untersuchte ich in Kapitel 6 die Enzymkinetik der Enzyme FDH und β- Galaktosidase in der physikalisch-chemischen Umgebung des Koazervats. Mit Hilfe von Michaelis-Menten-Experimenten in der CM-Dextran/PDDA-Bulkphase konnte gezeigt werden, dass KM und Vmax von FDH im Vergleich zum Überstand signifikant erhöht sind, wohingegen jene von β-Galaktosidase ein solches Verhalten nicht zeigen. Das führte mich zu der Hypothese, dass das negativ geladene Formiatsubstrat der FDH- Reaktion stark mit dem positiv geladenen PDDA interagiert, wodurch seine Affinität für das Enzym abnimmt. Darüber hinaus wird der ratenbegrenzende Hydridtransfer in der Umgebung des Koazervats erleichtert und es kann eine Erhöhung der Reaktionsrate beobachtet werden. Die Daten zeigen, dass abhängig vom Koazervat-Milieu die Enzymdynamik in verschiedene Richtungen gesteuert werden kann. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass meine Arbeit reaktionsfähige, steuerbare und enzymatisch aktive synthetische Zellsysteme mit Eigenschaften membranloser Kompartmentbildung etabliert. Meine Ergebnisse deuten darauf hin, dass membranlose Kompartimente einen signifikanten Einfluss auf die Dynamik enzymatischer Reaktio- nen haben. Meine Untersuchungen eröffnen damit neuartige Wege zur Kontrolle der Reaktionsgeschwindigkeit in synthetischen Systemen und erweitern das Verständnis möglicher Funktionen membranloser Organellen in vivo. Insgesamt zeige ich, dass über- legt entworfene synthetische Zellen eine hervorragende biomimetische Plattform bieten, um Einblicke in den Einfluss von membranloser Kompartimentierung auf enzymatische Reaktionen zu gewinnen. Teile der vorgestellten Arbeit wurden als wissenschaftliche Beiträge in zwei begutachteten Journalen als Erstautor veröffentlicht

Development of a platform process for the production and purification of single‐domain antibodies

Single-domain antibodies (sdAbs) offer the affinity and therapeutic value of conventional antibodies, with increased stability and solubility. Unlike conventional antibodies, however, sdAbs do not benefit from a platform manufacturing process. While successful production of a variety of sdAbs has been shown in numerous hosts, purification methods are often molecule specific or require affinity tags, which generally cannot be used in clinical manufacturing due to regulatory concerns. Here, we have developed a broadly applicable production and purification process for sdAbs in Komagataella phaffii (Pichia pastoris) and demonstrated the production of eight different sdAbs at a quality appropriate for nonclinical studies. We developed a two-step, integrated purification process without the use of affinity resins and showed that modification of a single process parameter, pH of the bridging buffer, was required for the successful purification of a variety of sdAbs. Further, we determined that this parameter can be predicted based only on the biophysical characteristics of the target molecule. Using these methods, we produced nonclinical quality sdAbs as few as 5 weeks after identifying the product sequence. Nonclinical studies of three different sdAbs showed that molecules produced using our platform process conferred protection against viral shedding of rotavirus or H1N1 influenza and were equivalent to similar molecules produced in Escherichia coli and purified using affinity tags

Development of a platform process for the production and purification of single‐domain antibodies

Single‐domain antibodies (sdAbs) offer the affinity and therapeutic value of conventional antibodies, with increased stability and solubility. Unlike conventional antibodies, however, sdAbs do not benefit from a platform manufacturing process. While successful production of a variety of sdAbs has been shown in numerous hosts, purification methods are often molecule specific or require affinity tags, which generally cannot be used in clinical manufacturing due to regulatory concerns. Here, we have developed a broadly applicable production and purification process for sdAbs in Komagataella phaffii (Pichia pastoris) and demonstrated the production of eight different sdAbs at a quality appropriate for nonclinical studies. We developed a two‐step, integrated purification process without the use of affinity resins and showed that modification of a single process parameter, pH of the bridging buffer, was required for the successful purification of a variety of sdAbs. Further, we determined that this parameter can be predicted based only on the biophysical characteristics of the target molecule. Using these methods, we produced nonclinical quality sdAbs as few as 5 weeks after identifying the product sequence. Nonclinical studies of three different sdAbs showed that molecules produced using our platform process conferred protection against viral shedding of rotavirus or H1N1 influenza and were equivalent to similar molecules produced in Escherichia coli and purified using affinity tags