Antivirale Cytokine in der frühen Phase der Woodchuck-Hepatitis-Virus-Infektion

In dieser Arbeit gelang erstmalig die Klonierung, Expression und Charakterisierung von Woodchuck Cytokinen. Damit wurde die Grundlage für die immunologische Untersuchung der Hepadnavirusinfektion in einem natürlichen Infektionsmodell geschaffen. Klonierung von Woodchuck cDNAs: TNF-a, IFN-g, IL-6, IL-15, IFN-g Rezeptor, b-Aktin und CD8 In dieser Arbeit wurde der vollständige offene Leserahmen der Woodchuck Cytokine TNF-a, IFN-g, IL-6, IL-15 und die extrazelluläre Region des IFN-g Rezeptors kloniert. Desweiteren wurden Teile der offenen Leserahmen des Haushaltgens b?Aktin und des Oberflächenrezeptors CD8 kloniert. Die Klone wurden sequenziert und die erhaltenen Sequenzen auf Aminosäureebene mit den entsprechenden Sequenzen anderer Spezies verglichen. Die Woodchuckproteine sind im gleichen Maß homolog zu den entsprechenden Proteinen anderer Spezies, wie diese untereinander. Bei TNF-a, IL-6 und IL-15 sind für die Rezeptorbindung wichtige Aminosäuren bei den verschiedenen Spezies konserviert. Es zeigte sich, daß die Übereinstimmung zwischen den Woodchuck Proteinen IFN-g, IL-15 und IFN-gR und den entsprechenden menschlichen Proteinen größer ist als zwischen den Woodchuck Proteinen und den Sequenzen anderer Nager. Expression und Analyse der Woodchuck Cytokine Die Funktionalität der Cytokinklone von TNF-a, IFN-g und IL-15 konnte mittels in dieser Arbeit etablierten Bioassays nach der Transfektion in Säugerzellen nachgewiesen werden. IFN-g und TNF-a wurden zusätzlich in E. coli exprimiert, damit eine größere Menge des jeweiligen Proteins gereinigt werden konnte. Die Reinigung und die Faltung der Proteine wurde durch Größenexclusionschromatographie überprüft und die Molekulargewichte bestimmt. Beide Proteine konnten funktionell exprimiert werden. Gegen die Woodchuck Proteine TNF-a und IFN-g konnten Antiseren generiert werden, die die Proteine sowohl im Immunoblot binden, als auch ihre biologische Aktivität in vitro inhibieren. Etablierung von Testsystemen zum Nachweis von Woodchuck Cytokinen Für die Cytokine TNF-a und IL-15 wurden Bioassays etabliert, die entsprechend den Tests für die murinen Cytokine durchgeführt werden konnten. Woodchuck TNF-a konnte mit löslichem murinen TNF-a Rezeptor I neutralisiert werden. IFN-g agiert speziesspezifisch, deshalb wurde für den Schutzassay die Woodchuckzellinie 12/6 benutzt. Woodchuck IFN-g konnte wie erwartet nicht mit humanem löslichem IFN-g Rezeptor neutralisiert werden. Die Bioassays zum Nachweis von TNF-a und IFN-g sind für die Quantifizierung der Cytokine aus Woodchuckserum geeignet. Für den Nachweis der Cytokine und T-Zellmarker aus Woodchuckgewebe konnte ein RNAse Protection Assay etabliert werden. TNF-a, IFN-g, CD3 und CD4 konnten mittels RNAse Protection Assay aus stimulierten Woodchucklymphozyten nachgewiesen werden. Es ist möglich mehrere mRNA Spezies in einem Hybridisierungsansatz nachzuweisen. Desweiteren wurden Plasmide für den Nachweis von IL?15, CD8 und b-Aktin kloniert. In vivo Neutralisation von IFN-g und TNF-a Vier Woodchucks wurden während einer Infektion mit WHV mit den in dieser Arbeit generierten und gereinigten Antikörpern behandelt. Diese Behandlung hatte keinen Einfluß auf die WHV Replikation, da die Kaninchenantikörper zu schnell abgebaut wurden. Aus diesem Grund ist die extrazelluläre Region des Woodchuck IFN-g Rezeptors kloniert worden. Das Experiment soll zukünftig mit löslichem TNF-a und IFN-g Rezeptor durchgeführt werden

Woodchuck Gamma Interferon Upregulates Major Histocompatibility Complex Class I Transcription but Is Unable To Deplete Woodchuck Hepatitis Virus Replication Intermediates and RNAs in Persistently Infected Woodchuck Primary Hepatocytes

Gamma interferon (IFN-γ) is an important mediator with multiple functions in the host defense against viral infection. IFN-γ, in concert with tumor necrosis factor alpha (TNF-α), leads to a remarkable reduction of intrahepatic replication intermediates and specific mRNAs of hepatitis B virus (HBV) by a noncytolytic mechanism in the transgenic mouse model. Thus, it is rational to evaluate the potential value of IFN-γ for the treatment of chronic HBV infection. In the present study, we expressed recombinant woodchuck IFN-γ (wIFN-γ) in Escherichia coli and mammalian cells. wIFN-γ protected woodchuck cells against infection of murine encephalomyocarditis virus in a species-specific manner. It upregulated the mRNA level of the woodchuck major histocompatibility complex class I (MHC-I) heavy chain in permanent woodchuck WH12/6 cells and regulated differentially the gene expression. However, the level of the replication intermediates and specific RNAs of woodchuck hepatitis virus (WHV) in persistently WHV-infected primary woodchuck hepatocytes did not change despite a treatment with 1,000 U of wIFN-γ per ml or with a combination of wIFN-γ and woodchuck TNF-α. Rather, hepatocytes derived from chronic carriers had an elevated level of the MHC-I heavy-chain mRNAs, most probably due to the exposure to inflammatory cytokines in vivo. Treatment with high doses of wIFN-γ led to an abnormal cell morphology and loss of hepatocytes. Thus, wIFN-γ regulates the gene expression in woodchuck hepatocytes but could not deplete WHV replication intermediates and mRNAs in persistently infected hepatocytes. The cellular response to wIFN-γ may be changed in hepatocytes from chronically WHV-infected woodchucks. It should be clarified in the future whether the continuous exposure of hepatocytes to inflammatory cytokines or the presence of viral proteins leads to changes of the cellular response to wIFN-γ