Study of nitric oxide inhibition in human eosinophil functions stimulated in vitro with eotaxin and RANTES

Orientador: Edson ArantesTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias MedicasResumo: Os eosinófilos participam da patogênese de várias doenças inflamatórias, incluindo infecções parasíticas e doenças alérgicas. Dentre as doenças alérgicas, a eosinofilia tem presença marcante na asma. Atualmente, a asma afeta 300 milhões de indivíduos no mundo, sendo considerada um problema de saúde pública mundial. A asma é uma doença inflamatória crônica que envolve interações entre fatores externos e genéticos, e tem como características principais a inflamação pulmonar e a hiperresponsividade brônquica. O recrutamento de eosinófilos para as vias aeríferas contribui para o caráter crônico da asma. A migração de eosinófilos para o tecido inflamado é um processo complexo, que é regulado por numerosos fatores, incluindo citocinas, quimiocinas, óxido nítrico (NO) e interações de moléculas de adesão. Estudos prévios investigaram as interações funcionais entre NO e CC-quimiocinas. Young e colaboradores (1999) mostraram que o número de eosinófilos no lavado broncoalveolar (LBA) de macacos desafiados está marcadamente aumentado 24 horas após o desafio, e que este aumento é acompanhado de altos níveis de NO no ar exalado e de eotaxina no LBA. Em pacientes com rinite, a eotaxina aumentou o número de eosinófilos no fluido do lavado nasal e também os níveis de NO nasal (Hanazawa et al., 1999). Em contraste, em modelos murinos de asma a inibição seletiva da NOS induzível resultou na redução da migração eosinofílica para os pulmões (Feder et al., 1997; Iijima et al., 2001), que estava associada com o aumento da expressão da CC-quimiocina proteína quimiotática para monócito-1 (MCP-1) no tecido pulmonar (Trifilieff et al., 2000). Além disso, NO (ou doadores de NO) também são capazes de inibir a produção de RANTES (Frank et al., 2000). O NO via formação de peroxinitrito (ONOO-) também pode reduzir a migração de eosinófilos induzida por eotaxina (Sato et al., 2000). Entretanto, o papel modulatório do NO nas funções do eosinófilo mediadas por CC-quimiocinas ainda permanece contraditório. Portanto, o presente trabalho investigou o efeito modulatório do NO na adesão aumentada, quimiotaxia e desgranulação do eosinófilo induzidas pelas Ccquimiocinas eotaxina e RANTES in vitro, e a expressão de VLA-4 e Mac-1 na superfície do eosinófilo. Nós realizamos ensaios funcionais (adesão e desgranulação), análise da expressão de moléculas de adesão por citometria de fluxo (VLA-4 e Mac-1) e a investigação de resíduos de tirosina nitrada para avaliar interações do NO com CC-quimiocinas em eosinófilos humanos. Os ensaios de MTT mostraram que as incubações de eosinófilos por 2, 3, ou 4 horas com eotaxina (10, 100 e 1000 ng/ml) ou RANTES (10, 100 e 1000 ng/ml) não afetam a viabilidade celular e, em determinadas condições, até promovem a ativação das células. Os resultados de adesão à fibronectina mostraram que a eotaxina (10, 100 e 1000 ng/ml) ou RANTES (10, 100 e 1000 ng/ml) não aumentam a adesão de eosinófilos em períodos de incubação de 2 e 3 horas. Entretanto, a incubação de eosinófilos por 4 horas com eotaxina ou RANTES aumentou significativamente a adesão à fibronectina. O L-NAME (0.1 mM), individualmente, aumentou significativamente a adesão de eosinófilos à fibronectina; porém a co-incubação de L-NAME com eotaxina (ou RANTES) não afetou a adesão observada com cada agente isoladamente. Além disso, a expressão de VLA-4 e de Mac-1 não foi modificada em nenhuma das condições experimentais testadas. Eotaxina e RANTES também não foram capazes de aumentar os níveis de GMPc nos eosinófilos, em condições onde o SNP (0.1 mM), usado como controle positivo, aumentou significativamente os níveis desse segundo mensageiro. Além disso, eosinófilos tratados com L-NAME, eotaxina e RANTES, individualmente, foram capazes de desgranular estas células, mas a co-incubação de LNAME com eotaxina (ou RANTES), não alterou esta resposta. Os resultados de quimiotaxia mostraram migração significativa de eosinófilos (tratados ou não com LNAME) em resposta à eotaxina ou RANTES. Os resultados obtidos de Western blotting para 3-nitrotirosina mostraram ausência de proteínas nitradas nos eosinófilos de indivíduos sadios ou asmáticos. No conjunto, nossos resultados mostram que, nas condições experimentais estabelecidas, o NO não modula adesão, migração e desgranulação em eosinófilos estimulados com eotaxina ou RANTESAbstract: Eosinophils participate in the pathogenesis of many inflammatory diseases, including parasitic infections and allergic diseases. Of the allergic diseases, asthma is characterized by eosinophilia. Currently, asthma affects 300 million people in world, and is an important public health problem. Asthma is an inflammatory chronic disease that involves interactions between external and genetic factors, and has lung inflammation and bronchial hyperresponsiveness as major features. The recruitment of eosinophils into airways contributes to the asthma chronic character. The eosinophil migration to inflamed tissue is a complex process regulated by several factors, including cytokines, chemokines, nitric oxide (NO) and adhesion molecule interactions. Previous studies have investigated the functional interactions between NO and CC-chemokines. Young et al. (1999) showed that the number of eosinophils in the bronchoalveolar lavage (BAL) fluid of challenged monkeys is markedly increased at 24 h post-challenge, accompanied by higher levels of both exhaled NO and eotaxin in BAL fluid. In rhinitis patients, eotaxin increased the number of eosinophils in the nasal lavage fluid, and that was also accompanied by elevated nasal NO levels (Hanazawa et al., 1999). In contrast, in murine models of asthma, selective inhibition of inducible NOS resulted in a reduction in pulmonary eosinophil migration (Feder et al., 1997; Iijima et al., 2001), with an increased expression of the CC-chemokine monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) in the lung tissue (Trifilieff et al., 2000). Moreover, NO (or NO donors) have also been shown to inhibit the production of RANTES (Frank et al., 2000). Nitric oxide via peroxynitrite (ONOO-) formation is reported to reduce eotaxin-induced eosinophil migration (Sato et al., 2000). However, the modulatory role of NO in the CC-chemokines-mediated eosinophil functions is still not well understood. Therefore, the present study was designed to investigate the modulatory effect of NO in the enhanced eosinophil adhesion, chemotaxis and degranulation induced by the Ccchemokines eotaxin and RANTES in vitro, and the expression of VLA-4 and Mac-1 on the eosinophil surface. We therefore carried out functional assays (adhesion and degranulation), flow cytometry analysis of adhesion molecules (VLA-4 and Mac-1 expression) and investigation of tyrosine nitration to evaluate the interactions between NO and CC-chemokines in human eosinophils. MTT assays showed that incubation of eosinophils for 2, 3 or 4 hours with eotaxin (10, 100 and 1000 ng/ml) or RANTES (10, 100 and 1000 ng/ml) did not affect cellular viability and, in some conditions, even caused cellular activation. The results of adhesion to fibronectin showed that eotaxin (10, 100 and 1000 ng/ml) or RANTES (10, 100 and 1000 ng/ml) did not increase eosinophil adhesion at 2 or 3 hours of incubation. Nevertheless, the incubation of eosinophils for 4 hours with eotaxin or RANTES significantly increased adhesion to fibronectin. L-NAME (0.1 mM), alone, significantly increased eosinophil adhesion to fibronectin; however the co-incubation of L-NAME with eotaxin (or RANTES) did not affect the adhesion of each agent. Moreover, expression of VLA-4 and Mac-1 were not modified by any of the experimental conditions. Eotaxin and RANTES did not increase eosinophil cGMP levels under the same conditions in which SNP (0.1mM), used as a positive control, significantly increased the levels of this second messenger. Furthermore, eosinophils treated with L-NAME, eotaxin and RANTES, alone, demonstrated degranulation, however the co-incubation of eosinophils with L-NAME and eotaxin (or RANTES) did not alter this response. Chemotaxis assays showed a significant eosinophil (treated or not with L-NAME) migration in response to eotaxin or RANTES. Western blotting for 3-nitrotyrosine-3 showed a lack of nitrated proteins in eosinophils from healthy or asthmatic donors. Taken together, results show that, under the experimental conditions established, NO does not modulate adhesion, migration and degranulation in eotaxin or RANTES-stimulated eosinophilsDoutoradoDoutor em Farmacologi

Avaliação do processo de extração liquido-liquido para recuperação e purificação do acido citrico

Orientadores: Maria Regina Wolf Maciel, Antonio Jose de Almeida MeirellesDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia QuimicaResumo: Este trabalho objetiva uma avaliação do desempenho do processo de extração liquido-liquido para a recuperação do ácido cítrico a partir de soluções aquosas utilizando solventes simples e misturas de solventes com extratante. Foram determinados dados experimentais de equilíbrio liquido-liquido para nove sistemas diferentes à temperatura de '25GRAUS¿C. Nos três sistemas ternários avaliados forma utilizados 2-Butanol, n-Butanol e 1-hexanol como extratantes. Nos sistemas quaternários seis misturas de solventes foram estudadas, 2-Butanol = (5 e 10%) Tricaprilina, n-Butanol + 5% tricaprilina e 2-Butanol + (5, 10 e 15%) NaCl. Os sistemas com efeito ¿salting out¿ apresentaram melhor desempenho, principalemnte o sistema 2-Butanol + 10% NaCl que apresentou melhores conficientes de separação, seletividade e regição de duas fases. A partir dos dados de equilíbrio liquido-liquido obtidos experimentalmente ajustaram-se os modelos NRTL e UNIQUAC com os parâmetros para os binários comuns aos sistemas tendo sido conservados constantes. Os modelos ajstados NRTL e UNIQUAC, expressos em fração mássica, apresentaram um arepresentação do equilíbrio liquido-liquido adequada para a maioria dos sistemas estudados com baixos desvios em relação aos dados experimentaisAbstract: This work deals whith the evaluation of the liquid-liquid extration performace for the recovery of citric acid from aqueous solution using simple solvents and mixed solvents, The experimental data of liquid-liquid equilibrium for nine different system at temperature of '25GRAUS¿C were obtained. First, the ternary systems composed by mixture of water, citric acid and solvent were evalued. 2-Butanol, n-Butanol and 1-Hexanol were used as solvents. Then, experiments of quaternary system formed by water, citric acid and mixture of solvents were developed. The evaluated mixed solvents were: 2-Butanol + (5 and 10%) Tricaprylin, n-Butanol + 5% Tricaprylin and 2-Butanol + (5,10 and 15%) Sodium Chlorite. The system with salt shoed better performace due to the salting out effect. The system constituted by water + 2-butanol + 10% sodium chlorite present the best results for the distribution coefficient data were used to carry out the adjustment of the NRTL and UNIQUAc thermodynamic model parameters. For this adjustment, the parameters for the binary ones common to the system were considered to be constant. The adjusted models NRTL and UNIQUAC, expressed in mass fraction, represented well the liquid-liquid equilibrium for the most of the studied system, showing low deviations from experimental dataMestradoMestre em Engenharia Químic

Evaluation of the liquid-liquid extraction process with salt addition for organic acid recovery and purification

Orientadores: Maria Regina Wolf Maciel, Antonio Jose de Almeida MeirellesTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia QuimicaResumo: Esse estudo objetiva uma avaliação crítica do processo de extração líquido-líquido de ácidos orgânicos, produzidos principalmente por fermentação. Os ácidos orgânicos de interesse nesse trabalho são: ácido cítrico, ácido málico, ácido succínico e ácido tartárico. O estudo engloba, de uma forma geral, a recuperação e a purificação dos ácidos orgânicos selecionados e, para esse propósito, envolve a caracterização termodinâmica dos sistemas envolvidos, a modelagem termodinâmica e a simulação do processo de extração líquidolíquido. Os dados de equilíbrio líquido-líquido foram obtidos a 25oC, e os alcoóis, 2- Butanol e n- Butanol foram avaliados como extratantes, considerando os sistemas ternários e os quaternários, com o efeito ¿salting out¿, onde o sal MgCl2 foi adicionado. A Modelagem Termodinâmica do equilíbrio líquido-líquido, através do Método de Contribuição de Grupos (UNIFAC-Larsen) e da Modelagem Molecular (NRTL e NRTL Eletrolítico), foi realizada em alguns casos considerando a presença de eletrólitos fortes provenientes da dissociação do sal nos sistemas quaternários, com efeito, ¿salting out¿Abstract: This study aims a critical evaluation of the liquid-liquid extraction process of organic acids, produced by fermentation. The organic acids of interest in this work are: citric acid, malic acid, succinic acid and tartaric acid. The study includes the recovery and the purification of the chosen organic acids, the thermodynamic characterization of the systems, thermodynamic modelling and simulation of the liquid-liquid extraction process. The liquid-liquid equilibrium data were obtained at 25oC, and the alcohols, 2-Butanol and n-Butanol were evaluated as extractants, considering the ternary systems and quaternary systems with salting out effect, where the salt MgCl2 was added. The Thermodynamic Modelling of the liquid-liquid equilibrium data, though the group contribution Method (UNIFAC-Larsen) and though Molecular Modelling (NRTL and the so-called electrolytic NRTL), was carried out in some cases considering the presence of strong electrolytes from the salt dissociation in the quaternary systems with salting out effectDoutoradoDesenvolvimento de Processos QuímicosDoutor em Engenharia Químic

Eosinophil and T Cell Markers Predict Functional Decline in COPD Patients

BACKGROUND. The major marker utilized to monitor COPD patients is forced expiratory volume in one second (FEV1). However, asingle measurement of FEV1 cannot reliably predict subsequent decline. Recent studies indicate that T lymphocytes and eosinophils are important determinants of disease stability in COPD. We therefore measured cytokine levels in the lung lavage fluid and plasma of COPD patients in order to determine if the levels of T cell or eosinophil related cytokines were predictive of the future course of the disease. METHODS. Baseline lung lavage and plasma samples were collected from COPD subjects with moderately severe airway obstruction and emphysematous changes on chest CT. The study participants were former smokers who had not had a disease exacerbation within the past six months or used steroids within the past two months. Those subjects who demonstrated stable disease over the following six months (ΔFEV1 % predicted = 4.7 ± 7.2; N = 34) were retrospectively compared with study participants who experienced a rapid decline in lung function (ΔFEV1 % predicted = -16.0 ± 6.0; N = 16) during the same time period and with normal controls (N = 11). Plasma and lung lavage cytokines were measured from clinical samples using the Luminex multiplex kit which enabled the simultaneous measurement of several T cell and eosinophil related cytokines. RESULTS AND DISCUSSION. Stable COPD participants had significantly higher plasma IL-2 levels compared to participants with rapidly progressive COPD (p = 0.04). In contrast, plasma eotaxin-1 levels were significantly lower in stable COPD subjects compared to normal controls (p < 0.03). In addition, lung lavage eotaxin-1 levels were significantly higher in rapidly progressive COPD participants compared to both normal controls (p < 0.02) and stable COPD participants (p < 0.05). CONCLUSION. These findings indicate that IL-2 and eotaxin-1 levels may be important markers of disease stability in advanced emphysema patients. Prospective studies will need to confirm whether measuring IL-2 or eotaxin-1 can identify patients at risk for rapid disease progression.National Heart, Lung, and Blood Institute (NO1-HR-96140, NO1-HR-96141-001, NO1-HR-96144, NO1-HR-96143; NO1-HR-96145; NO1-HR-96142, R01HL086936-03); The Flight Attendant Medical Research Institute; the Jo-Ann F. LeBuhn Center for Chest Diseas

Histórico dos incêndios na vegetação do Parque Nacional da Chapada Diamantina, entre 1973 e abril de 2010, com base em imagens Landsat

Wildfires are a serious threat to biodiversity conservation and the integrity of protected areas (PA). However, the occurrence of fire is part of the natural dynamics of various ecosystems. Among the Brazilian Federal PA, Chapada Diamantina National Park is the one that registers the largest number of fires. To assess the history of fires in this Park, Landsat satellite images were obtained on the internet, georeferenced and analyzed to identify the burned areas, recognized as dark "scars" in the satellite images. These scars were delimited and their areas calculated with GIS programs. Data were organized per year. For the period between 1973 and 1983, Landsat 1, 2 and 3, images with a spatial resolution of 80m, allowed the identification of 21.00 ± 20.24 polygons of fires per year, which affected 589.58 ± 680.79 ha, on average, in the Park, and 82.70 ± 89.70 polygons and 2244.86 ± 1272.70 ha in the surrounding area. Between 1984 and April 2010, using Landsat 5 images with a spatial resolution of 30m, the burned area found was 6,413.62 ± 4,025.38 ha in the Park (188.88 ± 194.54 polygons) and 6,125.49 ± 4,496.98 ha (441.40 ± 430.46 polygons) in AC. There is a great variability in the extent of annual fires that affect the Park. The years with the largest extensions burned were 1993 and 2008. In all, 61% of the area of the national plan was hit by fire during the period evaluated in this study. Not affected areas are concentrated in more humid regions and forest formations. The surrounding area had 37.6% of its area affected by fires. The data collected suggest that climatic factors such as the occurrence of El Niño may favor the occurrence of fires, although in the period between 2003 and 2008 this pattern had not observed. It is possible that the withdrawal of 18,000 head of cattle from the Park, in 2002, and the relative control of fires in the subsequent years favored the accumulation of biomass, making it very difficult to control the fires in 2008, when 41% of the park were affected by fire.Os incêndios são uma séria ameaça à conservação da biodiversidade e à integridade das Unidades de Conservação (UC). No entanto, a ocorrência de fogo faz parte da dinâmica natural de diversos ecossistemas. Entre as UC federais brasileiras, o Parque Nacional da Chapada Diamantina foi a que registrou o maior número de focos de incêndio entre os anos de 2003 e 2006. Para avaliar o histórico dos incêndios no Parque (1520km²) e em sua área circundante (AC: faixa de 10km ao redor do Parque), imagens de satélites LandSat foram obtidas na internet, georrefenciadas e analisadas para identificação das áreas queimadas, como "cicatrizes" escuras nas imagens de satélite. Estas cicatrizes foram delimitadas e suas áreas calculadas com programas de geoprocessamento. Os dados foram organizados anualmente. No período entre 1973 e 1983, utilizando imagens LandSat 1, 2 e 3, com resolução espacial de 80m, foram identificados (média ± DP) 21,00 ± 20,24 polígonos de incêndios anuais, que afetaram áreas com 589,58 ± 680,79 ha em média, no Parque, e 82,70 ± 89,70 polígonos e 2.244,86 ± 1.272,70 ha na AC. Entre 1984 e abril de 2010, utilizando imagens LandSat 5 com resolução espacial de 30m, a área queimada apurada foi de 6.413,62 ± 4.025,38 ha no PNCD (188,88 ± 194,54 polígonos) e 6.125,49 ± 4.496,98 ha (441,40 ± 430,46) na AC. Há uma grande variabilidade na extensão anual dos incêndios no Parque. Os anos em que se registraram as maiores extensões queimadas foram 1993 e 2008. Ao todo, 61% da área do Parque foi atingida pelo fogo no período avaliado no presente estudo. As áreas não atingidas se concentram em regiões mais úmidas e com formações florestais. A área circundante teve 37,6% de sua extensão atingida por incêndios. Os dados levantados sugerem que fatores climáticos, como a ocorrência do fenômeno El Niño, favorecem a ocorrência de incêndios, embora no período entre 2003 e 2008 não se tenha observado este padrão. É possível que a retirada de 18.000 cabeças de gado bovino do Parque em 2002 e que o relativo controle dos incêndios nos anos subseqüentes tenham favorecido o acúmulo de biomassa, tornando muito difícil o controle dos incêndios em 2008, quando 41% do Parque foram afetados pelo fogo.Â

Recorrência dos incêndios e fitossociologia da vegetação em áreas com diferentes regimes de queima no Parque Nacional da Chapada Diamantina

The occurrence of wildfires is a frequent disturbance in ecosystems, especially in savannas and grassland. In Brazil, little is known about the vegetation fire dynamics in regions such as the Chapada Diamantina, where there is a predominance of rocky fields. In this study, the recurrence of fires in the Chapada Diamantina National Park between 1985 and 2010 is described. Based on fire occurrence data, we determined sites with different burning schemes where underwent phytosociological analysis. The vegetation was divided into three components: graminoid, herbaceous and shrub-woody. Correlation tests were performed trying to determine the relationship between the coverage of these components at each site and time lapse between fires. The results showed that 59.41% of the National Park were hit by fire up to four events in the considered period, while 1.01% were achieved five to nine fire events. The habitats where wildfires were not registered included higher areas interspersed with deep river valleys at northern of Mucugê town. Other areas not affected by wildfires included seasonal forests and some "campo rupestre" areas at south and east of the town referred above. The map about the time since last burning shows the widest fire extensions in the interval that includes 2008's season (three to four years) when 41,93% of the National Park burned. The phytosociological analysis showed a low similarity between the areas. Differences in composition and coverage were related with sites phytophysiognomy and edaphic aspects. The graminoid component is the only one whose coverage was significantly correlated with the time between fires (F: 324.7204; r = 0.997, p = 0.0021). There is great variation in fire regime between different areas of the National Park, which has implications for its management. Areas where the outbreaks are less common, the direct fighting may be recommended. In areas with a higher recurrence rate, the adoption of control measures may be more effective. The coincidence observed between the recurrence of large fires and the likely occurrence of evergreen-of-Mucugê (Comanthera mucugensis (Giul.) L.R. Parra &amp; Giul.) indicates the need for additional protective actions and research on this species and associated ecosystems.A ocorrência de incêndios florestais é uma perturbação freqüente em ecossistemas, especialmente nas regiões savânicas e campestres. No Brasil, pouco se conhece sobre a dinâmica dos incêndios em regiões como a Chapada Diamantina, Bahia, onde há a predominância de campos rupestres. Neste estudo, a recorrência dos incêndios no Parque Nacional da Chapada Diamantina é avaliada no período entre 1985 e 2010. Com base nos dados sobre a ocorrência de incêndios, foram determinados sítios com diferentes regimes de queima onde se realizaram levantamentos fitossociológicos. Além dos procedimentos usuais neste tipo de levantamento, a vegetação foi dividida em três componentes: graminóides, herbáceas e arbustivo-arbóreas. Testes de correlação foram realizados, para verificar se há relação entre a cobertura por estes elementos em cada sitio e o tempo decorrido entre os incêndios. Os resultados obtidos demonstraram que 59,41% do parque foram atingidos por até quatro eventos de incêndios no período considerado, enquanto 1,01% foram atingidos por cinco a nove eventos de queima. Os ambientes onde os incêndios na vegetação não foram registrados incluíram áreas elevadas entremeadas por vales profundos de rios ao norte da cidade de Mucugê. Outras áreas não afetadas por incêndios incluíram florestas estacionais e alguns campos rupestres ao sul e ao leste da cidade citada. O mapa sobre o tempo decorrido desde a última queima mostra que as maiores extensões afetadas no intervalo de tempo que inclui a temporada de 2008 (três a quatro anos), quando 41,93% do parque nacional foram queimados. A análise fitossociológica mostrou uma baixa similaridade entre as áreas e permitiu correlacionar as diferenças encontradas com as fitofisionomias dos sítios amostrados e aspectos edáficos. Apenas o componente graminóide teve sua cobertura média fortemente correlacionada com o tempo médio entre os incêndios (F = 324,7204; r = 0,9969; p = 0,0021). Os resultados obtidos mostram que há uma grande variação no regime de queima entre as diversas áreas do Parque, o que tem implicações para seu manejo. Em áreas onde os focos são menos comuns, o combate direto pode ser recomendado. Em áreas com maior recorrência, a adoção de medidas de controle pode ser mais eficaz. A coincidência observada entre a grande recorrência de incêndios e a ocorrência de sempre-viva-de-mucugê (Comanthera mucugensis (Giul.) L.R. Parra &amp; Giul.) indica a necessidade de medidas adicionais de proteção e pesquisa sobre esta espécie e ecossistemas associados.Â

Human eosinophil adhesion and degranulation stimulated with eotaxin and RANTES in vitro: Lack of interaction with nitric oxide

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Airway eosinophilia is considered a central event in the pathogenesis of asthma. The toxic components of eosinophils are thought to be important in inducing bronchial mucosal injury and dysfunction. Previous studies have suggested an interaction between nitric oxide (NO) and chemokines in modulating eosinophil functions, but this is still conflicting. In the present study, we have carried out functional assays (adhesion and degranulation) and flow cytometry analysis of adhesion molecules (VLA-4 and Mac-1 expression) to evaluate the interactions between NO and CC-chemokines (eotaxin and RANTES) in human eosinophils.</p> <p>Methods</p> <p>Eosinophils were purified using a percoll gradient followed by immunomagnetic cell separator. Cell adhesion and degranulation were evaluated by measuring eosinophil peroxidase (EPO) activity, whereas expression of Mac-1 and VLA-4 was detected using flow cytometry.</p> <p>Results</p> <p>At 4 h incubation, both eotaxin (100 ng/ml) and RANTES (1000 ng/ml) increased by 133% and 131% eosinophil adhesion, respectively. L-NAME alone (but not D-NAME) also increased the eosinophil adhesion, but the co-incubation of L-NAME with eotaxin or RANTES did not further affect the increased adhesion seen with chemokines alone. In addition, L-NAME alone (but not D-NAME) caused a significant cell degranulation, but it did not affect the CC-chemokine-induced cell degranulation. Incubation of eosinophils with eotaxin or RANTES, in absence or presence of L-NAME, did not affect the expression of VLA-4 and Mac-1 on eosinophil surface. Eotaxin and RANTES (100 ng/ml each) also failed to elevate the cyclic GMP levels above baseline in human eosinophils.</p> <p>Conclusion</p> <p>Eotaxin and RANTES increase the eosinophil adhesion to fibronectin-coated plates and promote cell degranulation by NO-independent mechanisms. The failure of CC-chemokines to affect VLA-4 and Mac-1 expression suggests that changes in integrin function (avidity or affinity) are rather involved in the enhanced adhesion.</p

Metformin attenuates the exacerbation of the allergic eosinophilic inflammation in high fat-diet-induced obesity in mice

A positive relationship between obesity and asthma has been well documented. The AMP-activated protein kinase (AMPK) activator metformin reverses obesity-associated insulin resistance (IR) and inhibits different types of inflammatory responses. This study aimed to evaluate the effects of metformin on the exacerbation of allergic eosinophilic inflammation in obese mice. Male C57BL6/J mice were fed for 10 weeks with high-fat diet (HFD) to induce obesity. The cell infiltration and inflammatory markers in bronchoalveolar lavage (BAL) fluid and lung tissue were evaluated at 48 h after ovalbumin (OVA) challenge. HFD obese mice displayed peripheral IR that was fully reversed by metformin (300 mg/kg/day, two weeks). OVA-challenge resulted in higher influx of total cell and eosinophils in lung tissue of obese mice compared with lean group. As opposed, the cell number in BAL fluid of obese mice was reduced compared with lean group. Metformin significantly reduced the tissue eosinophil infiltration and prevented the reduction of cell counts in BAL fluid. In obese mice, greater levels of eotaxin, TNF-α and NOx, together with increased iNOS protein expression were observed, all of which were normalized by metformin. In addition, metformin nearly abrogated the binding of NF-κB subunit p65 to the iNOS promoter gene in lung tissue of obese mice. Lower levels of phosphorylated AMPK and its downstream target acetyl CoA carboxylase (ACC) were found in lung tissue of obese mice, which were restored by metformin. In separate experiments, the selective iNOS inhibitor aminoguanidine (20 mg/kg, 3 weeks) and the anti-TNF-α mAb (2 mg/kg) significantly attenuated the aggravation of eosinophilic inflammation in obese mice. In conclusion, metformin inhibits the TNF-α-induced inflammatory signaling and NF-κB-mediated iNOS expression in lung tissue of obese mice. Metformin may be a good pharmacological strategy to control the asthma exacerbation in obese individuals.Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, 2012/14225-