Isolation, biochemical characterization and ultra-structure of the A1AO ATPase from Methanococcus jannaschii

Die A1AO-ATPase wurde aus Membranen von M. jannaschii unter Erhalt der Struktur isoliert. Das Enzym wurde durch eine Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation, eine Anionenaustauschchromato-graphie an DEAE und eine Gelfiltration zur Homogenität gereinigt. Alle 9 aus der Operon-Struktur vorhergesagten Untereinheiten konnten mittels Western-Blot-Analyse oder einer N-terminalen Sequenzierung identifiziert werden. Die funktionelle Kopplung der A1- und AO-Domäne wurde durch Studien mit dem Inhibitor DCCD nachgewiesen. Das gereinigte Enzym hatte eine Masse von 670 kDa. Die ATP-Hydrolyseaktivität war bei einer Temperatur von 80°C und einem pH-Wert von 6 optimal. Der KM-Wert für MgATP wurde zu 1,2±0,2 mM bestimmt. Bei den Versuchen zur Entwicklung eines Na+-freien Tespuffers trat die strikte Abhängikeit des Enzyms von Hydrogensulfit oder Sulfit als Problem zu Tage. Aus Membranen von M. jannaschii wurden durch Chloroform/Methanol Lipide extrahiert, aus denen dann Liposomen hergestellt wurden. Die A1AO-ATPase aus M. jannaschii wurde in diese Liposomen erfolgreich rekonstituiert, eine ATP-Synthese konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. Die elektronenmikroskopischen Analysen zeigten einen für ATPasen charakteristischen Aufbau, aus einer hydrophilen Domäne, die durch mindestens zwei Stiele mit der Membrandomäne verbunden ist. Anhand der Bildrekonstruktion von 17.238 Einzelpartikeln konnten zwei Klassen von ATPase-Molekülen unterschieden werden, die entweder über einen oder zwei periphere Stiele verfügten. Aus verschiedenen Einzelprojektionen wurden Summenbilder generiert, anhand dieser 2D- Rekonstruktion wurde die ATPase vermessen. Der Kopfteil, die Membrandomäne und der zentrale Stiel haben eine Größe von 11,5 x 9,4 nm, 10,6 x 6,4 nm und 8 x 3,9 nm (Länge x Breite). Die Gesamtlänge des Enzyms betrug 25,9 nm. Der zentrale Stiel der ATPase ist über der Membran von einer Kragen-ähnlichen Struktur umgeben, die wiederum mit den peripheren Stielen in Kontakt steht. Scheinbar steht nur einer der peripheren Stiele in direktem Kontakt mit der AO-Domäne. Die Überlagerung der 3D-Rekonstruktion eines A1-Subkomplexes aus Methanosarcina mazei mit der 2D-Rekonstruktion der A1AO-ATPase aus M. jannaschii zeigen deutlich, dass die peripheren Stiele mit dem oberen Ende der A1-Domäne in Kontakt stehen. Durch diese Analysen konnte erstmals die Struktur einer A1AO-ATPase mit einer Auflösung von 1,8 nm dargestellt werden. Sequenzanalysen haben gezeigt, dass das Proteolipid-Gen von Methanopyrus kandleri verdreizehnfacht ist. Das Gen wurde mittels PCR vervielfacht und in einen TOPO®-Vektor kloniert. Versuche das Gen in einen Expressionsvektor umzuklonieren, waren noch nicht erfolgreich.Archaeal A1AO ATP synthase/ATPase operons are highly conserved among species and are comprised of at least nine genes encoding structural proteins. However, all A1AO ATPase preparations reported to date contained only three to six subunits and, therefore, the study of this unique class of secondary energy converters is still in its infancy. To improve the quality of A1AO ATPase preparations we chose the hyperthermophilic, methanogenic archaeon Methanococcus jannaschii as a model organism. Individual subunits of the A1AO ATPase from M. jannaschii were produced in E. coli, purified, and antibodies were raised. The antibodies enabled the development of a protocol ensuring purification of the entire nine-subunit A1AO ATPase. The ATPase was solubilized from membranes of M. jannaschii by Triton X-100 and purified to apparent homogeneity by sucrose density gradient centrifugation, ion exchange chromatography and gel filtration. Electron micrographs revealed the A1 and AO domains and the central stalk, but also additional masses which could represent a second stalk. Inhibitor studies were used to demonstrate that the A1 and AO domains are functionally coupled. This is the first description of an A1AO ATPase preparation in which the two domains (A1 and AO) are fully conserved and functionally coupled

Structure and subunit arrangement of the A-type ATP synthase complex from the archaeon Methanococcus jannaschii visualized by electron microscopy

In Archaea, bacteria, and eukarya, ATP provides metabolic energy for energy-dependent processes. It is synthesized by enzymes known as A-type or F-type ATP synthase, which are the smallest rotatory engines in nature (Yoshida, M., Muneyuki, E., and Hisabori, T. (2001) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2, 669-677; Imamura, H., Nakano, M., Noji, H., Muneyuki, E., Ohkuma, S., Yoshida, M., and Yokoyama, K. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 2312-2315). Here, we report the first projected structure of an intact A(1)A(0) ATP synthase from Methanococcus jannaschii as determined by electron microscopy and single particle analysis at a resolution of 1.8 nm. The enzyme with an overall length of 25.9 nm is organized in an A(1) headpiece (9.4 x 11.5 nm) and a membrane domain, A(0) (6.4 x 10.6 nm), which are linked by a central stalk with a length of approximately 8 nm. A part of the central stalk is surrounded by a horizontal-situated rodlike structure ("collar"), which interacts with a peripheral stalk extending from the A(0) domain up to the top of the A(1) portion, and a second structure connecting the collar structure with A(1). Superposition of the three-dimensional reconstruction and the solution structure of the A(1) complex from Methanosarcina mazei Gö1 have allowed the projections to be interpreted as the A(1) headpiece, a central and the peripheral stalk, and the integral A(0) domain. Finally, the structural organization of the A(1)A(0) complex is discussed in terms of the structural relationship to the related motors, F(1)F(0) ATP synthase and V(1)V(0) ATPases

Structure and Subunit Arrangement of the A-type ATP Synthase Complex from the Archaeon Methanococcus jannaschii Visualized by Electron Microscopy

In Archaea, bacteria, and eukarya, ATP provides metabolic energy for energy-dependent processes. It is synthesized by enzymes known as A-type or F-type ATP synthase, which are the smallest rotatory engines in nature. Here, we report the first projected structure of an intact A1A0 ATP synthase from Methanococcus jannaschii as determined by electron microscopy and single particle analysis at a resolution of 1.8 nm. The enzyme with an overall length of 25.9 nm is organized in an A1 headpiece (9.4 × 11.5 nm) and a membrane domain, A0 (6.4 × 10.6 nm), which are linked by a central stalk with a length of ~8 nm. A part of the central stalk is surrounded by a horizontal-situated rod-like structure (“collar”), which interacts with a peripheral stalk extending from the A0 domain up to the top of the A1 portion, and a second structure connecting the collar structure with A1. Superposition of the three-dimensional reconstruction and the solution structure of the A1 complex from Methanosarcina mazei Gö1 have allowed the projections to be interpreted as the A1 headpiece, a central and the peripheral stalk, and the integral A0 domain. Finally, the structural organization of the A1A0 complex is discussed in terms of the structural relationship to the related motors, F1F0 ATP synthase and V1V0 ATPases.