Reduced Enzymatic Browning in Potato Tubers by Specific Editing of a Polyphenol Oxidase Gene via Ribonucleoprotein Complexes Delivery of the CRISPR/Cas9 System

Polyphenol Oxidases (PPOs) catalyze the conversion of phenolic substrates to quinones, leading to the formation of dark-colored precipitates in fruits and vegetables. This process, known as enzymatic browning, is the cause of undesirable changes in organoleptic properties and the loss of nutritional quality in plant-derived products. In potato (Solanum tubersoum L.), PPOs are encoded by a multi-gene family with different expression patterns. Here, we have studied the application of the CRISPR/Cas9 system to induce mutations in the StPPO2 gene in the tetraploid cultivar Desiree. We hypothesized that the specific editing of this target gene would result in a lower PPO activity in the tuber with the consequent reduction of the enzymatic browning. Ribonucleoprotein complexes (RNPs), formed by two sgRNAs and Cas9 nuclease, were transfected to potato protoplasts. Up to 68% of regenerated plants contained mutations in at least one allele of the target gene, while 24% of edited lines carried mutations in all four alleles. No off-target mutations were identified in other analyzed StPPO genes. Mutations induced in the four alleles of StPPO2 gene, led to lines with a reduction of up to 69% in tuber PPO activity and a reduction of 73% in enzymatic browning, compared to the control. Our results demonstrate that the CRISPR/Cas9 system can be applied to develop potato varieties with reduced enzymatic browning in tubers, by the specific editing of a single member of the StPPO gene family.Fil: Gonzalez, Matías Nicolás. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Buenos Aires Sur. Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Massa, Gabriela Alejandra. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Buenos Aires Sur. Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Andersson, Mariette. Swedish University of Agricultural Sciences; SueciaFil: Turesson, Helle. Swedish University of Agricultural Sciences; SueciaFil: Olsson, Niklas. Swedish University of Agricultural Sciences; SueciaFil: Fält, Ann Sofie. Swedish University of Agricultural Sciences; SueciaFil: Storani, Leonardo. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Buenos Aires Sur. Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Décima Oneto, Cecilia Andrea. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Buenos Aires Sur. Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; ArgentinaFil: Hofvander, Per. Swedish University of Agricultural Sciences; SueciaFil: Feingold, Sergio. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Buenos Aires Sur. Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentin

Reduced enzymatic browning in potato tubers by specific editing of a Polyphenol oxidase gene via Ribonucleoprotein complexes delivery of the CRISPR/Cas9 System.

Polyphenol Oxidases (PPOs) catalyze the conversion of phenolic substrates to quinones, leading to the formation of dark-colored precipitates in fruits and vegetables. This process, known as enzymatic browning, is the cause of undesirable changes in organoleptic properties and the loss of nutritional quality in plant-derived products. In potato (Solanum tubersoum L.), PPOs are encoded by a multi-gene family with different expression patterns. Here, we have studied the application of the CRISPR/Cas9 system to induce mutations in the StPPO2 gene in the tetraploid cultivar Desiree. We hypothesized that the specific editing of this target gene would result in a lower PPO activity in the tuber with the consequent reduction of the enzymatic browning. Ribonucleoprotein complexes (RNPs), formed by two sgRNAs and Cas9 nuclease, were transfected to potato protoplasts. Up to 68% of regenerated plants contained mutations in at least one allele of the target gene, while 24% of edited lines carried mutations in all four alleles. No off-target mutations were identified in other analyzed StPPO genes. Mutations induced in the four alleles of StPPO2 gene, led to lines with a reduction of up to 69% in tuber PPO activity and a reduction of 73% in enzymatic browning, compared to the control. Our results demonstrate that the CRISPR/Cas9 system can be applied to develop potato varieties with reduced enzymatic browning in tubers, by the specific editing of a single member of the StPPO gene family.EEA BalcarceFil: González, Matías Nicolás. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET); Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; ArgentinaFil: Massa, Gabriela Alejandra. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET); Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Agraria; Argentina.Fil: Andersson, Mariette. Swedish University of Agricultural Sciences, Department of Plant Breeding; SueciaFil: Turesson, Helle. Swedish University of Agricultural Sciences, Department of Plant Breeding; SueciaFil: Olsson, Niklas. Swedish University of Agricultural Sciences, Department of Plant Breeding; SueciaFil: Fält, Ann-Sofie. Swedish University of Agricultural Sciences, Department of Plant Breeding; SueciaFil: Storani, Leonardo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET); Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; ArgentinaFil: Decima Oneto, Cecilia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; ArgentinaFil: Hofvander, Per. Swedish University of Agricultural Sciences, Department of Plant Breeding; SueciaFil: Feingold, Sergio. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina

Comparative analysis of CRISPR/Cas9 delivery approaches for polyphenol oxidase 2 gene editing in potato

PosterStPPO2 gene editing was analyzed by Agrobacterium mediated transformation with CR-PPO vector, ribonucleoprotein complexes (RNP-PPO) transfection to protoplasts, and CR-PPO transient expression in protoplasts, yielding efficiencies of 9.6%, 18.4%, and 31.9%, respectively. Transient expression of CR-PPO in protoplasts resulted in tetra-allelic edited lines, observed in 46% of total edited lines. On-target DNA insertions were found in lines from all three approaches. Loss of function of the StPPO2 protein was confirmed in a tetra-allelic edited line.EEA BalcarceFil: González, Matías Nicolás. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible; Argentina.Fil: Massa, Gabriela Alejandra. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible; Argentina.Fil: Massa, Gabriela Alejandra. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía; Argentina.Fil: Anderson, Mariette. Swedish University of Agricultural Sciences. Department of Plant Breeding; Suecia.Fil: Décima Oneto, Cecilia Andrea. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible; Argentina.Fil: Décima Oneto, Cecilia Andrea. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía; Argentina.Fil: Turesson, Helle. Swedish University of Agricultural Sciences. Department of Plant Breeding; Suecia.Fil: Storani, Leonardo. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible; Argentina.Fil: Olsson, Niklas. Swedish University of Agricultural Sciences. Department of Plant Breeding; Suecia.Fil: Fält , Ann Sofie. Swedish University of Agricultural Sciences. Department of Plant Breeding; Suecia.Fil: Hofvander, Per. Swedish University of Agricultural Sciences. Department of Plant Breeding; Suecia.Fil: Feingold, Sergio Enrique. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible; Argentina

Transformación eficiente de Solanum tuberosum cv. Spunta mediada por Agrobacterium tumefaciens utilizando higromicina como agente selectivo

La transformación genética de plantas es una herramienta biotecnológica de alto impacto en el mejoramiento vegetal, que brinda la posibilidad de obtener nuevos cultivos que se adapten a las demandas de producción y de consumo. Actualmente la estrategia de transformación más utilizada en papa se basa en la incorporación de genes completos vía Agrobacterium tumefaciens. El objetivo del presente trabajo fue desarrollar el primer protocolo de transformación para Solanum tuberosum cv. Spunta mediado por Agrobacterium tumefaciens utilizando el antibiótico higromicina como agente de selección. Para ello se transformaron explantes de papa cv. Spunta utilizando A. tumefaciens con un vector binario conteniendo el gen hpt, que confiere resistencia al antibiótico higromicina. Se realizaron determinaciones moleculares y fenotípicas, para validar tanto la eficiencia del protocolo de transformación como la acción del antibiótico higromicina como agente de selección. Se obtuvieron 62 ápices regenerados de los explantes inoculados con A. tumefaciens (62% de regeneración) de las cuales 30 plantas fueron positivas para el gen hpt. Considerando como eficiencia de transformación el número de plantas transgénicas / el número de explantes inoculados, obtuvimos un 30 % de eficiencia. El presente trabajo permitió desarrollar un protocolo sencillo y eficiente de transformación genética de papa cv. Spunta mediante A. tumefaciens utilizando higromicina como agente selectivo.Plant genetic transformation is a biotechnological tool with a high impact on plant breeding since it offers the possibility of introducing new traits in crops to fulfill the demands of production and consumption. The most widely used transformation strategy in potato is based on integration of genes via A. tumefaciens. The objective of the present work was to develop a transformation protocol for Solanum tuberosum cv. Spunta mediated by A. tumefaciens using hygromycin as a selective agent. For this, explants of potato cv. Spunta were transformed using A. tumefaciens with a binary vector containing the hygromycin conferring resistance transgene (hpt) under the control of NOS promoter. Molecular and phenotypic determinations were performed to validate both the efficiency of the transformation protocol and the performance of hygromycin as a selection agent. Sixty-two regenerated shoots were obtained from explants inoculated with A. tumefaciens (62% regeneration) of which 30 plants were positive for the hpt gene. Thirty percent transformation efficiency -calculated as the number of transgenic plants / the number of explants inoculated- was obtained using this protocol. The present work developed presents a simple and efficient protocol for genetic transformation of potato cv. Spunta by A. tumefaciens using hygromycin as a selective agent.Fil: Décima Oneto, Cecilia Andrea. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Buenos Aires Sur. Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; ArgentinaFil: Coronel, Joel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Buenos Aires Sur. Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; ArgentinaFil: Storani, Leonardo. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Buenos Aires Sur. Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; ArgentinaFil: Gonzalez, M. N.. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Buenos Aires Sur. Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; ArgentinaFil: Feingold, Sergio. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Buenos Aires Sur. Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; ArgentinaFil: Massa, Gabriela Alejandra. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Buenos Aires Sur. Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentin

El diagnóstico de COVID-19 en Balcarce como parte del enfoque “Una Salud”

En el artículo, presentamos el trayecto recorrido por nuestro equipo en respuesta a la necesidad concreta de la sociedad Balcarceña, contar con la posibilidad de diagnosticar COVID19 a nivel local.EEA BalcarceFil: Louge Uriarte, Enrique. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible; Argentina.Fil: Romeo, Florencia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina.Fil: Rey, Florencia. Agencia Nacional de Promoción de la Investigación, el Desarrollo Tecnológico y la Innovación; Argentina.Fil: Cantón, Germán. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible; Argentina.Fil: Storani, Leonardo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina.Fil: Moore, Dadín Prando. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencia Agrarias; Argentina.Fil: Zimmermann, Julián. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina.Fil: Verna, Andrea Elizabeth. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible; Argentina

AtCBF1 Overexpression Confers Tolerance to High Light Conditions at Warm Temperatures in Potato Plants

We characterized transcriptional responses of potato plants to multiple abiotic stresses and used this information to identify potential mechanisms through which overexpression of the stress related transcription factor CBF1 from Arabidopsis thaliana (AtCBF1) confers multiple stress tolerance. Most transcriptional changes were specific to each condition, but genes involved in phenyl-propanoid biosynthesis were affected by all abiotic stresses evaluated. Interestingly, over-expression of AtCBF1 in potato plants not only conferred tolerance to low temperatures, as previously reported, but also to high-light conditions at 22 °C, suggesting that it confers multiple stress tolerance by enhancing the ability of plants to cope with an excess of radiant energy. Finally, we found that transcriptional changes triggered by abiotic stress were much larger than those resulting from AtCBF1 over-expression in potato, revealing that overexpression of an heterologous transcription factor causes minor alterations in the plant transcriptome in comparison to transcriptional changes triggered by abiotic stresses.Caracterizamos respuestas transcripcionales de plantas de papa a múltiples estreses abióticos y utilizamos esta información para identificar mecanismos potenciales a través de los cuales la sobreexpresión del factor de transcripción CBF1 relacionado con agobio de Arabidopsis thaliana (AtCBF1) confiere tolerancia múltiple al estrés. La mayoría de los cambios transcripcionales fueron específicos para cada condición, pero se afectaron los genes involucrados en la biosíntesis de fenil-propanoides por todos los estreses abióticos evaluados. Interesantemente, la sobreexpresión del AtCBF1 en plantas de papa no solo confirieron tolerancia a bajas temperaturas, como se ha reportado previamente, sino también a condiciones de alta luminosidad a 22 °C, lo que sugiere múltiple tolerancia al estrés mediante el aumento de la habilidad de las plantas para hacer frente a un exceso de energía radiante. Finalmente, encontramos que los cambios transcripcionales disparados por el agobio abiótico fueron mayores que aquellos que resultaron de la sobreexpresión de AtCBF1 en papa, revelando que la sobreexpresión de un factor heterólogo de transcripción causa alteraciones menores en el transcriptoma de la planta en comparación a cambios transcripcionales disparados por estreses abióticos.Fil: Storani, Leonardo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Fisiológicas y Ecológicas Vinculadas a la Agricultura. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía. Instituto de Investigaciones Fisiológicas y Ecológicas Vinculadas a la Agricultura; ArgentinaFil: Hernando, Carlos Esteban. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Staneloni, Roberto Julio. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Ploschuk, Edmundo Leonardo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Fisiológicas y Ecológicas Vinculadas a la Agricultura. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía. Instituto de Investigaciones Fisiológicas y Ecológicas Vinculadas a la Agricultura; ArgentinaFil: Rugnone, Matias Leandro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Fisiológicas y Ecológicas Vinculadas a la Agricultura. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía. Instituto de Investigaciones Fisiológicas y Ecológicas Vinculadas a la Agricultura; ArgentinaFil: Striker, Gustavo Gabriel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Fisiológicas y Ecológicas Vinculadas a la Agricultura. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía. Instituto de Investigaciones Fisiológicas y Ecológicas Vinculadas a la Agricultura; ArgentinaFil: Casal, Jorge Jose. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Fisiológicas y Ecológicas Vinculadas a la Agricultura. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía. Instituto de Investigaciones Fisiológicas y Ecológicas Vinculadas a la Agricultura; Argentina. Fundación Instituto Leloir; ArgentinaFil: Chernomoretz, Ariel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Física; ArgentinaFil: Yanovsky, Marcelo Javier. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Fisiológicas y Ecológicas Vinculadas a la Agricultura. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía. Instituto de Investigaciones Fisiológicas y Ecológicas Vinculadas a la Agricultura; Argentina. Fundación Instituto Leloir; Argentin

CRISPR/Cas9 for potato functional genomics and breeding

Cultivated potato (Solanum tuberosum L.) is one of the most important staple food crops worldwide. Its tetraploid and highly heterozygous nature pose a great challenge to its basic research and trait improvement through traditional mutagenesis and/or crossbreeding. The establishment of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) and CRISPR-associated protein 9 (Cas9) as a gene-editing tool has allowed the alteration of specific gene sequences and their concomitant gene function, providing powerful technology for potato gene functional analysis and improvement of elite cultivars. This technology relies on a short RNA molecule called single guide RNA (sgRNA) that directs the Cas9 nuclease to induce a site-specific double-stranded break (DSB). Further, repair of the DSB by the error-prone non-homologous end joining (NHEJ) mechanism, leads to the introduction of targeted mutations, which can be used to produce the loss of function of specific gene/s. In this chapter, we describe experimental procedures to apply the CRISPR/Cas9 technology for potato genome editing. First, we provide strategies for target selection and sgRNA design and describe a Golden Gate-based cloning system to obtain a sgRNA/Cas9-encoding binary vector. We also describe an optimized protocol for ribonucleoprotein complexes (RNP) assembly. The binary vector can be used for both Agrobacterium-mediated transformation and transient expression in potato protoplasts, while the RNP complexes are intended to obtain edited potato lines through protoplast transfection and plant regeneration. Finally, we describe procedures to identify the gene-edited potato lines. The methods described here are suitable for potato gene functional analysis and breeding.Fil: Gonzalez, Matías Nicolás. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible - Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Buenos Aires Sur. Estación Experimental Agropecuaria Balcarce. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible; ArgentinaFil: Massa, Gabriela Alejandra. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible - Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Buenos Aires Sur. Estación Experimental Agropecuaria Balcarce. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible; ArgentinaFil: Andersson, Mariette. No especifíca;Fil: Storani, Leonardo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible - Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Buenos Aires Sur. Estación Experimental Agropecuaria Balcarce. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible; ArgentinaFil: Olsson, Niklas. No especifíca;Fil: Décima Oneto, Cecilia Andrea. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible - Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Buenos Aires Sur. Estación Experimental Agropecuaria Balcarce. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible; ArgentinaFil: Hofvander, Per. No especifíca;Fil: Feingold, Sergio. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible - Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Buenos Aires Sur. Estación Experimental Agropecuaria Balcarce. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible; Argentin

Comparative potato genome editing: Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation and protoplasts transfection delivery of CRISPR/Cas9 components directed to StPPO2 gene

Delivery of the CRISPR/Cas9 components to the plant cells is a key step in its application as a genome editing tool. Here, we compared Agrobacterium-mediated transformation and protoplast transfection with CRISPR/Cas9 components for potato genome editing. Two sgRNAs were designed to simultaneously direct Cas9 to the StPPO2 gene encoding for a tuber polyphenol oxidase (PPO). A binary vector (CR-PPO) was utilized for either Agrobacterium-mediated transformation or for transient expression in protoplasts, while ribonucleoprotein complexes (RNP-PPO) were additionally assayed in protoplasts. Editing efficiency varied, yielding 9.6%, 18.4% and 31.9% of edited lines from Agrobacterium-mediated transformation, RNP-PPO and CR-PPO transient expression in protoplasts, respectively. Furthermore, only the CR-PPO transient expression resulted in lines edited in all four StPPO2 alleles, observed in 46% of the edited lines and confirmed by tuber PPO activity and enzymatic browning analysis. Lines with on-target DNA insertions were found from all three approaches and characterized by sequencing. The dual-sgRNA strategy resulted in a low incidence of the targeted deletion, likely due to contrasting efficiencies between sgRNAs, that was partially evident in the in silico analysis. Our results demonstrate that gene editing efficiency in potato depends on the CRISPR/Cas9 delivery strategy and provide insights to consider when selecting the appropriate methodology.EEA BalcarceFil: González, Matías Nicolás. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible; Argentina.Fil: Massa, Gabriela Alejandra. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible; Argentina.Fil: Massa, Gabriela Alejandra. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía; Argentina.Fil: Anderson, Mariette. Swedish University of Agricultural Sciences. Department of Plant Breeding; Suecia.Fil: Décima Oneto, Cecilia Andrea. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible; Argentina.Fil: Décima Oneto, Cecilia Andrea. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía; Argentina.Fil: Turesson, Helle. Swedish University of Agricultural Sciences. Department of Plant Breeding; Suecia.Fil: Storani, Leonardo. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible; Argentina.Fil: Olsson, Niklas. Swedish University of Agricultural Sciences. Department of Plant Breeding; Suecia.Fil: Fält , Ann Sofie. Swedish University of Agricultural Sciences. Department of Plant Breeding; Suecia.Fil: Hofvander, Per. Swedish University of Agricultural Sciences. Department of Plant Breeding; Suecia.Fil: Feingold, Sergio Enrique. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible; Argentina

A Constitutive Shade-Avoidance Mutant Implicates TIR-NBS-LRR Proteins in Arabidopsis Photomorphogenic Development

In plants, light signals caused by the presence of neighbors accelerate stem growth and flowering and induce a more erect position of the leaves, a developmental strategy known as shade-avoidance syndrome. In addition, mutations in the photoreceptors that mediate shade-avoidance responses enhance disease susceptibility in Arabidopsis thaliana. Here, we describe the Arabidopsis constitutive shade-avoidance1 (csa1) mutant, which shows a shade-avoidance phenotype in the absence of shade and enhanced growth of a bacterial pathogen. The csa1 mutant has a T-DNA inserted within the second exon of a Toll/Interleukin1 receptor–nucleotide binding site–leucine-rich repeat (TIR-NBS-LRR) gene, which leads to the production of a truncated mRNA. Arabidopsis plants transformed with the truncated TIR-NBS-LRR gene recapitulate the mutant phenotype, indicating that csa1 is a dominant-negative mutation that interferes with phytochrome signaling. TIR-NBS-LRR proteins have been implicated in defense responses in plants. RPS4, the closest homolog of CSA1, confers resistance to Pseudomonas syringae and complements the csa1 mutant phenotype, indicating that responses to pathogens and neighbors share core-signaling components in Arabidopsis. In Drosophila melanogaster and Caenorhabditis elegans, TIR domain proteins are implicated in both development and immunity. Thus, the dual role of the TIR domain is conserved across kingdoms

Study of the dynamics of in vitro infection with bovine gammaherpesvirus type 4 and apoptosis markers in susceptible cells

Bovine gammaherpesvirus type 4 (BoHV-4) shows tropism for the endometrium, in which it causes the death of epithelial and stroma cells. Despite having anti-apoptotic genes in its genome, experiments based on immortalized cell lines have shown that BoHV-4 induces cell death by apoptosis. In the present study, we evaluated BoHV-4 replication, pro-apoptotic (Bax) and anti-apoptotic (Bcl-2) mitochondrial genes expression and chromatin condensation in bovine endometrium primary culture cells (BEC) and in the Madin Darby bovine kidney (MDBK) cell line. Results showed that BoHV-4 has a preference for replication in BEC cells over the MDBK cell line, demonstrated by the high viral titer that is consistent with the tropism of the virus. In BEC cells, chromatin condensation was consistent with the values of viral kinetics at the late stage of infection, accompanied with a balance in the mRNA levels of apoptotic mitochondrial proteins. As a consequence, in those cells viral transmission would be enhanced by inhibiting apoptosis in the early stage of virus proliferation, allowing the complete production of viral progeny, and then, the induction of apoptosis in late stages would allow neighboring cells infection. In MDBK cells replication kinetics was coincident with the up-regulation of Bcl-2, which suggests that the productive infection in MDBK is associated with a lytic phase of the virus or another cell death pathway (probably autophagy mechanism) at the late stage of infection. The results agree with the study of nuclear morphology, where a constant chromatin condensation was observed over time. It is clear that the documented BoHV-4 apoptotic responses observed in the cell lines studied above are not valid in cells from primary cultures. The data presented in this study suggest that BoHV-4 could induce apoptosis in BEC cells without a leading role of the mitochondria pathway. Further studies will be necessary to characterize in detail the programmed cell death pathways involved in BoHV-4 infection in the primary cell cultures evaluated.EEA BalcarceFil: Romeo, Florencia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina.Fil: Romeo, Florencia. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Agrarias; Argentina.Fil: Delgado, Santiago. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Agrarias; Argentina.Fil: Louge Uriarte, Enrique. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible; Argentina.Fil: Storani, Leonardo. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible; Argentina.Fil: Storani, Leonardo. Agencia Nacional de Promoción de la Investigación, el Desarrollo Tecnológico y la Innovación; Argentina.Fil: Martínez Cuesta, Lucia. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Agrarias; Argentina.Fil: Martínez Cuesta, Lucia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina.Fil: Morán, Pedro. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina.Fil: González Altamiranda, Erika. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible; Argentina.Fil: Odeón, Anselmo. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Agrarias; Argentina.Fil: Pérez, Sandra. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil; Argentina.Fil: Verna, Andrea. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible; Argentina