Role of TPSO-STAR in mitochondrial cholesterol accumulation during myocardial ischemia-reperfusion

L’infarctus du myocarde et ses conséquences représentent un problème de santé publique majeur. Les facteurs de comorbidité aggravants tels que l’hypercholestérolémie et l’obésité prennent des proportions épidémiques importantes et sont reconnus pour limiter l’efficacité des stratégies cardioprotectrices développées notamment dans les études précliniques. Dans ce contexte, le laboratoire d’accueil a précédemment démontré l’existence d’une relation entre l’accumulation intramitochondriale de cholestérol, le stress oxydant et la dysfonction mitochondriale. La limitation pharmacologique de cette accumulation de cholestérol a protégé les mitochondries cardiaques au cours de l’infarctus du myocarde, aussi bien chez des animaux normo- qu’hyper-cholestérolémiques, cette accumulation ne résultant pas d’un moindre catabolisme du cholestérol. Par ailleurs, il est démontré dans les tissus stéroidogéniques que les mouvements intracellulaires de cholestérol impliquent notamment deux protéines que sont TSPO (protéine translocatrice) et STAR (Steroidogenic Acute Regulatory protein). Ainsi notre hypothèse de travail repose sur la nécessité de contrôler les niveaux de cholestérol mitochondrial pour protéger la cellule. Dans une première partie de ce projet de thèse, nous avons étudié les mécanismes impliquant le couple TSPO-STAR dans l'entrée de cholestérol dans les mitochondries lors de l'ischémie-reperfusion grâce à une approche pharmacologique via l’administration de 4’-chlorodiazépam, un ligand de TSPO, et une approche génétique avec l’utilisation de rats délétés pour TSPO (collaboration avec le Pr Papadopoulos, Montréal, Canada). L’ischémie-reperfusion induit la translocation de STAR dans la mitochondrie, concomitante de l’entrée de cholestérol. Ces phénomènes sont limités par l’administration de 4’-CDZ, le ligand de TSPO, montrant une implication de ce récepteur dans les mouvements de cholestérol lors de l’ischémie-reperfusion myocardique. Le caractère indispensable de STAR s’est révélé chez les rats délétés pour TSPO où sa translocation est toujours effective et que le cholestérol continue de s’accumuler. La délétion de TSPO a permis également de mettre en lumière le rôle essentiel de TSPO dans les effets cardioprotecteurs du 4’-CDZ qui sont abolis chez les rats délétés pour TSPO. Dans une deuxième partie de ce travail, nous nous sommes intéressés à une démarche translationnelle avec l’étude d’un double ligand TSPO/GABA-A qui possède une autorisation de mise sur le marché (AMM) comme anxiolytique et montre des effets neuroprotecteurs intéressants dans les modèles d’ischémies cérébrales. Malgré une absence de protection de l’infarctus myocardique à la phase aiguë, l’administration répétée d’étifoxine au cours de la reperfusion, aggrave les lésions d’ischémie-reperfusion dans la semaine qui suit, mettant en exergue un rôle de TSPO dans les mécanismes de réparation et/ou de cicatrisation dans les suites d’un infarctus. Au total, l’ensemble de ce travail montre l’importance de l’interaction TSPO-STAR pour promouvoir l’entrée mitochondriale de cholestérol qui est secondairement oxydé en oxystérols. Les expériences utilisant la perte de fonction TSPO soulignent un rôle primordial de STAR dans ces phénomènes et son ciblage devenant alors une piste pharmacologique d’intérêt. Enfin, l’utilisation de l’étifoxine suggère l’intérêt d’approfondir l’exploration des voies de signalisation dépendant de TSPO dans la phase de cicatrisation et de réparation afin d’identifier de nouvelles stratégies pharmacologiques.Myocardial infarction and its consequences represent a major public health issue. The incidence of comorbidity factors such as hypercholesterolemia and obesity is constantly growing and these factors are known to blunt or abolish the effectiveness of cardioprotective strategies developed mainly in preclinical studies. In this context, the laboratory has previously demonstrated a relationship between intramitochondrial cholesterol accumulation, oxidative stress, and mitochondrial dysfunction. The pharmacological limitation of this cholesterol accumulation protects the cardiac mitochondria during myocardial infarction, both in normo- and hyper-cholesterolemic animals. This accumulation does not result from reduced cholesterol catabolism.Furthermore, it has been demonstrated in steroidogenic tissues that the cholesterol's intracellular movements involve mainly two proteins, TSPO (translocator protein) and STAR (Steroidogenic Acute Regulatory protein). Thus, our working hypothesis aims at controlling mitochondrial cholesterol levels to protect the cell. In the first part of this thesis, we investigated the mechanisms involving the TSPO-STAR couple in the cholesterol's entry into the mitochondria during ischemia-reperfusion thanks to a pharmacological approach via the administration of 4'- chlorodiazepam, a TSPO ligand, and a genetic approach with the use of TSPO-deleted rats (collaboration with Pr Papadopoulos, Montreal, Canada). Ischemia-reperfusion induced the translocation of STAR in the mitochondria, concomitant with the entry of cholesterol. These phenomena were limited by the administration of 4'-CDZ, the TSPO ligand, showing the involvement of this receptor in cholesterol movements during myocardial ischemia-reperfusion. The mandatory role of STAR was revealed in TSPO-deleted rats where its translocation was still effective, and cholesterol continued to accumulate. The deletion of TSPO also sheds light on the essential role of TSPO in the cardioprotective effects of 4'-CDZ, which are abolished in rats deleted for TSPO. In the second part of this work, we focused on a double TSPO/GABA-A ligand, etifoxine, in a translational perspective. Indeed, this double ligand already has marketing authorization as an anxiolytic and shows interesting neuroprotective effects in models of cerebral ischemia. Despite a lack of protection against myocardial infarction during the acute phase, repeated administrations of etifoxine worsened ischemia-reperfusion injury during the following week, highlighting a role of TSPO in repair mechanisms and/or scarring following myocardial infarction. In conclusion, our investigations highlight the interaction between TSPO and STAR to promote the mitochondrial entry of cholesterol which is secondarily oxidized into oxysterols. Furthermore, experiments using the TSPO loss of function underline the fundamental role of STAR in these phenomena, placing STAR as potential target for future pharmacological developments. Finally, investigating the effects of etifoxine suggests the interest of exploring TSPO-dependent signaling pathways in the healing and repair phases to identify new pharmacological strategies for myocardial infarction

Rôle du couple TSPO-STAR dans l'accumulation du cholestérol dans la mitochondrie au cours de l'ischémie-reperfusion myocardique.

Myocardial infarction and its consequences represent a major public health issue. The incidence of comorbidity factors such as hypercholesterolemia and obesity is constantly growing and these factors are known to blunt or abolish the effectiveness of cardioprotective strategies developed mainly in preclinical studies. In this context, the laboratory has previously demonstrated a relationship between intramitochondrial cholesterol accumulation, oxidative stress, and mitochondrial dysfunction. The pharmacological limitation of this cholesterol accumulation protects the cardiac mitochondria during myocardial infarction, both in normo- and hyper-cholesterolemic animals. This accumulation does not result from reduced cholesterol catabolism.Furthermore, it has been demonstrated in steroidogenic tissues that the cholesterol's intracellular movements involve mainly two proteins, TSPO (translocator protein) and STAR (Steroidogenic Acute Regulatory protein). Thus, our working hypothesis aims at controlling mitochondrial cholesterol levels to protect the cell. In the first part of this thesis, we investigated the mechanisms involving the TSPO-STAR couple in the cholesterol's entry into the mitochondria during ischemia-reperfusion thanks to a pharmacological approach via the administration of 4'- chlorodiazepam, a TSPO ligand, and a genetic approach with the use of TSPO-deleted rats (collaboration with Pr Papadopoulos, Montreal, Canada). Ischemia-reperfusion induced the translocation of STAR in the mitochondria, concomitant with the entry of cholesterol. These phenomena were limited by the administration of 4'-CDZ, the TSPO ligand, showing the involvement of this receptor in cholesterol movements during myocardial ischemia-reperfusion. The mandatory role of STAR was revealed in TSPO-deleted rats where its translocation was still effective, and cholesterol continued to accumulate. The deletion of TSPO also sheds light on the essential role of TSPO in the cardioprotective effects of 4'-CDZ, which are abolished in rats deleted for TSPO. In the second part of this work, we focused on a double TSPO/GABA-A ligand, etifoxine, in a translational perspective. Indeed, this double ligand already has marketing authorization as an anxiolytic and shows interesting neuroprotective effects in models of cerebral ischemia. Despite a lack of protection against myocardial infarction during the acute phase, repeated administrations of etifoxine worsened ischemia-reperfusion injury during the following week, highlighting a role of TSPO in repair mechanisms and/or scarring following myocardial infarction. In conclusion, our investigations highlight the interaction between TSPO and STAR to promote the mitochondrial entry of cholesterol which is secondarily oxidized into oxysterols. Furthermore, experiments using the TSPO loss of function underline the fundamental role of STAR in these phenomena, placing STAR as potential target for future pharmacological developments. Finally, investigating the effects of etifoxine suggests the interest of exploring TSPO-dependent signaling pathways in the healing and repair phases to identify new pharmacological strategies for myocardial infarction.L’infarctus du myocarde et ses conséquences représentent un problème de santé publique majeur. Les facteurs de comorbidité aggravants tels que l’hypercholestérolémie et l’obésité prennent des proportions épidémiques importantes et sont reconnus pour limiter l’efficacité des stratégies cardioprotectrices développées notamment dans les études précliniques. Dans ce contexte, le laboratoire d’accueil a précédemment démontré l’existence d’une relation entre l’accumulation intramitochondriale de cholestérol, le stress oxydant et la dysfonction mitochondriale. La limitation pharmacologique de cette accumulation de cholestérol a protégé les mitochondries cardiaques au cours de l’infarctus du myocarde, aussi bien chez des animaux normo- qu’hyper-cholestérolémiques, cette accumulation ne résultant pas d’un moindre catabolisme du cholestérol. Par ailleurs, il est démontré dans les tissus stéroidogéniques que les mouvements intracellulaires de cholestérol impliquent notamment deux protéines que sont TSPO (protéine translocatrice) et STAR (Steroidogenic Acute Regulatory protein). Ainsi notre hypothèse de travail repose sur la nécessité de contrôler les niveaux de cholestérol mitochondrial pour protéger la cellule. Dans une première partie de ce projet de thèse, nous avons étudié les mécanismes impliquant le couple TSPO-STAR dans l'entrée de cholestérol dans les mitochondries lors de l'ischémie-reperfusion grâce à une approche pharmacologique via l’administration de 4’-chlorodiazépam, un ligand de TSPO, et une approche génétique avec l’utilisation de rats délétés pour TSPO (collaboration avec le Pr Papadopoulos, Montréal, Canada). L’ischémie-reperfusion induit la translocation de STAR dans la mitochondrie, concomitante de l’entrée de cholestérol. Ces phénomènes sont limités par l’administration de 4’-CDZ, le ligand de TSPO, montrant une implication de ce récepteur dans les mouvements de cholestérol lors de l’ischémie-reperfusion myocardique. Le caractère indispensable de STAR s’est révélé chez les rats délétés pour TSPO où sa translocation est toujours effective et que le cholestérol continue de s’accumuler. La délétion de TSPO a permis également de mettre en lumière le rôle essentiel de TSPO dans les effets cardioprotecteurs du 4’-CDZ qui sont abolis chez les rats délétés pour TSPO. Dans une deuxième partie de ce travail, nous nous sommes intéressés à une démarche translationnelle avec l’étude d’un double ligand TSPO/GABA-A qui possède une autorisation de mise sur le marché (AMM) comme anxiolytique et montre des effets neuroprotecteurs intéressants dans les modèles d’ischémies cérébrales. Malgré une absence de protection de l’infarctus myocardique à la phase aiguë, l’administration répétée d’étifoxine au cours de la reperfusion, aggrave les lésions d’ischémie-reperfusion dans la semaine qui suit, mettant en exergue un rôle de TSPO dans les mécanismes de réparation et/ou de cicatrisation dans les suites d’un infarctus. Au total, l’ensemble de ce travail montre l’importance de l’interaction TSPO-STAR pour promouvoir l’entrée mitochondriale de cholestérol qui est secondairement oxydé en oxystérols. Les expériences utilisant la perte de fonction TSPO soulignent un rôle primordial de STAR dans ces phénomènes et son ciblage devenant alors une piste pharmacologique d’intérêt. Enfin, l’utilisation de l’étifoxine suggère l’intérêt d’approfondir l’exploration des voies de signalisation dépendant de TSPO dans la phase de cicatrisation et de réparation afin d’identifier de nouvelles stratégies pharmacologiques

Effects of TSPO and STAR inhibitors on cell death in a cardiomyocyte model of hypoxia-reoxygenation

International audienceHypoxia-reoxygenation TSPO-STAR Introduction We previously demonstrated that reperfusion of an ischemic myocardium induces an increase in mitochondrial cholesterol (CL) content accompanied by a generation of oxysterols. The translocator protein (TSPO) and the steroid acute regulatory protein (STAR) are involved in CL transport at the mitochondrial membrane in steroidogenic tissues but in the heart their role remain uncertain. The TSPO ligand 4'-chlorodiazepam (4'CDZ) has been demonstrated to inhibit STAR and sterols mitochondrial accumulations and to reduce infarct size. These data suggest that targeting mitochondrial sterol accumulation could participate to the protective effects of TSPO ligands. Objective To analyze the mechanisms and the role of the mitochondrial CL transport in cell death with a cardiomyocyte model of hypoxiareoxygenation (HR). Method AC16 human cardiomyocytes were submitted to different durations of hypoxia (1% O2) followed by reoxygenation (21% O2) to achieve 50% mortality. Cells were then treated at reoxygenation with 4'CDZ and novel TSPO and STAR inhibitors, known to delay steroidogenesis in vitro by targeting CL specific binding sites of these proteins (CRAC and START, respectively). Cell mortality was assessed with MTT and crystal violet assay and CL was identified by means of fluorescent probes. Results HR induced 41±3% mortality and modified membrane CL pattern in the cells. In this model, 4'-CDZ (10 µM) did not display cardioprotective effect (44±3% mortality). Similar results were observed with the TSPO inhibitors (CRAC benzamide 100 µM, CRAC triol 100 µM) and the STAR inhibitor (START triol 100 µM) (46±1% 43±3% and 54±3% mortality, respectively). Conclusion This preliminary study suggests that TSPO ligands do not exert cardioprotection through a direct action on cardiomyocytes. This conclusion needs to be confirmed with the use of adult primary cardiomyocytes

Cardioprotective Signaling Pathways in Obese Mice Submitted to Regular Exercise: Effect on Oxysterols

Exercise induces cardioprotection against myocardial infarction, despite obesity, by restoring pro-survival pathways and increasing resistance of mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening at reperfusion. Among the mechanisms involved in the inactivation of these pathways, oxysterols appear interesting. Thus, we investigated the influence of regular exercise on the reperfusion injury salvage kinase (RISK) pathway, oxysterols, and mitochondria, in the absence of ischemia-reperfusion. We also studied 7β-hydroxycholesterol (7βOH) concentration (mass spectrometry) in human lean and obese subjects. Wild-type (WT) and obese (ob/ob) mice were assigned to sedentary conditions or regular treadmill exercise. Exercise significantly increased Akt phosphorylation, whereas 7βOH concentration was reduced. Moreover, exercise induced the translocation of PKCε from the cytosol to mitochondria. However, exercise did not affect the calcium concentration required to open mPTP in the mitochondria, neither in WT nor in ob/ob animals. Finally, human plasma 7βOH concentration was consistent with observations made in mice. In conclusion, regular exercise enhanced the RISK pathway by increasing kinase phosphorylation and PKCε translocation and decreasing 7βOH concentration. This activation needs the combination with stress conditions, i.e., ischemia-reperfusion, in order to inhibit mPTP opening at the onset of reperfusion. The human findings suggest 7βOH as a candidate marker for evaluating cardiovascular risk factors in obesity

Identification of a mechanism promoting mitochondrial sterol accumulation during myocardial ischemia–reperfusion: role of TSPO and STAR

International audienceHypercholesterolemia is a major risk factor for coronary artery diseases and cardiac ischemic events. Cholesterol per se could also have negative effects on the myocardium, independently from hypercholesterolemia. Previously, we reported that myocardial ischemia-reperfusion induces a deleterious build-up of mitochondrial cholesterol and oxysterols, which is potentiated by hypercholesterolemia and prevented by translocator protein (TSPO) ligands. Here, we studied the mechanism by which sterols accumulate in cardiac mitochondria and promote mitochondrial dysfunction. We performed myocardial ischemia-reperfusion in rats to evaluate mitochondrial function, TSPO and steroidogenic acute regulatory protein (STAR) levels and the related mitochondrial concentrations of sterols. Rats were treated with the cholesterol synthesis inhibitor pravastatin or the TSPO ligand 4’-chlorodiazepam. We used Tspo deleted rats, which were phenotypically characterized. Inhibition of cholesterol synthesis reduced mitochondrial sterol accumulation and protected mitochondria during myocardial ischemia-reperfusion. We found that cardiac mitochondrial sterol accumulation is the consequence of enhanced influx of cholesterol and not of the inhibition of its mitochondrial metabolism during ischemia-reperfusion. Mitochondrial cholesterol accumulation at reperfusion was related to an increase in mitochondrial STAR but not to changes in TSPO levels. 4’-Chlorodiazepam inhibited this mechanism and prevented mitochondrial sterol accumulation and mitochondrial ischemia-reperfusion injury, underlying the close cooperation between STAR and TSPO. Conversely, Tspo deletion, which did not alter cardiac phenotype, abolished the effects of 4’-chlorodiazepam. This study reveals a novel mitochondrial interaction between TSPO and STAR to promote cholesterol and deleterious sterol mitochondrial accumulation during myocardial ischemia-reperfusion. This interaction regulates mitochondrial homeostasis and plays a key role during mitochondrial injury