Сократительные белки сосудистых гладкомышечных клеток – универсальные маркеры сосудов микроциркуляторного русла

Highlights. The use of vascular smooth muscle cell markers, e.g. smooth muscle myosin heavy chain (SM-MHC) and alpha smooth muscle actin (α-SMA) for immunodetection of adventitial and perivascular microvessels (vasa vasorum) is preferrable over endothelial markers (CD31 and VE-cadherin) as it allows to define vascular geometry regardless of sectioning artifacts and provides ideal signal-to-noise ratio.Aside from elastic laminae which discriminate arterioles from venules and capillaries, we were unable to confirm any specific markers of arterial, venous, and capillary differentiation, although KLF2 and PROX1 transcription factors indicated venous specification and HEY1 suggested capillary identity in rat aortas.Aim. To develop an optimal approach to detection of microvessels and to evaluate the techniques for the differential immunostaining of arterioles, venules, and capillaries in human saphenous veins and rat aortas.Methods. Saphenous veins excised during the coronary artery bypass graft surgery were used for the study. Serial cryosections were analyzed by means of haematoxylin and eosin and Russell-Movat’s pentachrome stainings and by immunofluorescent staining for endothelial cell markers (CD31 and VE-cadherin), vascular smooth muscle cell markers (SM-MHC and α-SMA), mechanosensitive transcription factors (KLF2 and KLF4), transcription factors of arterial specification (HES1, HEY1, ERG), transcription factors and markers of venous identity (NR2F2, NRP2), and transcription factors and markers of lymphatic lineage (PROX1, LYVE1, VEGFR3). Samples were visualized by light and confocal microscopy.Results. In comparison with endothelial cell markers (CD31 and VE-cadherin), vascular smooth muscle cell markers (SM-MHC and α-SMA) permitted objective evaluation of vascular geometry and maximized signal-to-noise ratio irrespective of specific marker, microvessel specification or antibody used. Autofluorescence and specific histological  pattern  of  elastic  membranes  at  Russell-Movat’s  pentachrome staining allowed to discriminate arterioles from venules and capillaries. Albeit immunostaining of rat aortas found specific markers of venous endothelial cells (KLF2 and PROX1) and capillary endothelial cells (HEY1), these findings have not been confirmed in saphenous veins. We were unable to find specific markers of human venules and capillaries among the saphenous vein vasa vasorum despite an extensive screening of multiple markers.Conclusion. Immunodetection of microvessels (e.g., vasa vasorum) should be performed by using vascular smooth muscle cell markers (SM-MHC and α-SMA) rather than endothelial cell markers (CD31 and VE-cadherin). Lack of specific markers to discern microvessels of different lineages suggests Russell-Movat’s pentachrome staining as an optimal option for the machine learning of neural networks to analyse the microvessels including vasa vasorum.Основные положения. Показано, что использование маркеров сосудистых гладкомышечных клеток, к примеру тяжелых цепей миозина гладких мышц (SM-MHC) и альфа-актина гладких мышц (α-SMA), для иммунодетекции сосудов микроциркуляторного русла сосудистой стенки (vasa vasorum) предпочтительнее применения эндотелиальных маркеров (CD31 и VE-кадгерин), поскольку позволяет определять сосудистую геометрию вне зависимости от артефактов пробоподготовки и обеспечивает идеальное соотношение «сигнал – шум».За исключением эластических мембран, позволяющих дифференцировать артериолы от венул и капилляров, в тканях сосудов взрослого человека не выявлено специфичных маркеров артериальной, венозной и капиллярной дифференцировки, хотя в аортах крыс маркерами венозной дифференцировки служили транскрипционные факторы KLF2 и PROX1, а маркером капиллярной дифференцировки – транскрипционный фактор HEY1.Цель. Разработать оптимальный способ детекции сосудов микроциркуляторного русла и оценить подходы к дифференциальному окрашиванию артериол, венул и капилляров на примере сети vasa vasorum большой подкожной вены (БПВ) человека и аорты крысы.Материалы и методы. Для исследования использовали сегменты БПВ, извлеченные в процессе коронарного шунтирования, а также аорты нормолипидемических и нормотензивных крыс Wistar. Серийные криосрезы анализировали при помощи окрашивания гематоксилином и эозином, пентахромного окрашивания по Расселлу – Мовату, иммунофлюоресцентного окрашивания на маркеры эндотелиальных клеток (ЭК) (CD31 и VE-кадгерин), сосудистых гладкомышечных клеток (СГМК) (SM-MHC и α-SMA), механочувствительных транскрипционных факторов (KLF2 и KLF4), транскрипционные факторы артериальной дифференцировки (HES1, HEY1, ERG), транскрипционные факторы и маркеры венозной дифференцировки (NR2F2, NRP2), транскрипционные факторы и маркеры лимфатической дифференцировки (PROX1, LYVE1, VEGFR3), а также иммуногистохимического окрашивания на маркеры венозной дифференцировки NR2F2. Готовые микропрепараты анализировали посредством световой и конфокальной микроскопии.Результаты. В  сравнении  с  маркерами  ЭК  (CD31  и VE-кадгерином)  маркеры  СГМК (SM-MHC и α-SMA) позволяли осуществлять объективную визуализацию и оценку сосудистой геометрии и обеспечивали максимальное соотношение «сигнал – шум» независимо от вида маркера, типа сосуда или антитела. Аутофлюоресценция и специфичный гистологический паттерн эластических мембран в ходе окрашивания по Расселлу – Мовату позволяли дифференцировать артериолы от остальных сосудов микроциркуляторного русла. Несмотря на то что иммуноокрашивание аорт крыс показало специфичные маркеры венозного (KLF2 и PROX1) и капиллярного (HEY1) эндотелия, данные находки не нашли подтверждения при иммуноокрашивании БПВ человека. Таким образом, специфичных маркеров венул и капилляров в тканях взрослого человека не идентифицировано, несмотря на анализ широкой палитры классических маркеров различных эндотелиальных дифферонов.Заключение. Для иммунодетекции сосудов микроциркуляторного русла целесообразно использовать маркеры СГМК (SM-MHC и α-SMA), а не маркеры ЭК (CD31 и VE-кадгерин). Отсутствие специфичных маркеров дифференцировки микрососудов (в частности vasa vasorum) позволяет предположить пентахромное окрашивание по Расселлу – Мовату в качестве оптимальной опции для машинного обучения нейронных сетей с целью анализа сосудов микроциркуляторного русла

EXPERIMENTAL ESTIMATION OF COMPOSITE MATERIAL CONTAINING THE PROTEIN-MINERAL COMPONENTS AND RECOMBINANT BONE MORPHOGENETIC PROTEIN-2 AS A COVERING OF TITANIUM IMPLANTS

The influence of both, the composite material based on the protein-mineral components including the prolonged form of the recombinant human bone morphogenetic protein 2 (rhBMP-2) and the method of the titanium implant’s surface treatment, on the reparative osteogenesis and adhesion strength of the bone tissue – implant’s surface contact was evaluated. Covering of implants with the composite coating promotes significant acceleration of the bone tissue regeneration processes in the site of implants loading. The composition coating with prolonged form of the rhBMP-2 promoted increasing of the neogenic bone tissue’s adhesion with the implants, as compared with the coating without recombinant human bone morphogenetic protein. The implants treated with microarc oxidation demonstrated higher values of the breakout force during the separation of the implants from the bone than the implants treated with sandblasting method