Molecular Dynamics Simulations Suggest that Electrostatic Funnel Directs Binding of Tamiflu to Influenza N1 Neuraminidases

Oseltamivir (Tamiflu) is currently the frontline antiviral drug employed to fight the flu virus in infected individuals by inhibiting neuraminidase, a flu protein responsible for the release of newly synthesized virions. However, oseltamivir resistance has become a critical problem due to rapid mutation of the flu virus. Unfortunately, how mutations actually confer drug resistance is not well understood. In this study, we employ molecular dynamics (MD) and steered molecular dynamics (SMD) simulations, as well as graphics processing unit (GPU)-accelerated electrostatic mapping, to uncover the mechanism behind point mutation induced oseltamivir-resistance in both H5N1 “avian” and H1N1pdm “swine” flu N1-subtype neuraminidases. The simulations reveal an electrostatic binding funnel that plays a key role in directing oseltamivir into and out of its binding site on N1 neuraminidase. The binding pathway for oseltamivir suggests how mutations disrupt drug binding and how new drugs may circumvent the resistance mechanisms

Detailed Analysis of Sequence Changes Occurring during vlsE Antigenic Variation in the Mouse Model of Borrelia burgdorferi Infection

Lyme disease Borrelia can infect humans and animals for months to years, despite the presence of an active host immune response. The vls antigenic variation system, which expresses the surface-exposed lipoprotein VlsE, plays a major role in B. burgdorferi immune evasion. Gene conversion between vls silent cassettes and the vlsE expression site occurs at high frequency during mammalian infection, resulting in sequence variation in the VlsE product. In this study, we examined vlsE sequence variation in B. burgdorferi B31 during mouse infection by analyzing 1,399 clones isolated from bladder, heart, joint, ear, and skin tissues of mice infected for 4 to 365 days. The median number of codon changes increased progressively in C3H/HeN mice from 4 to 28 days post infection, and no clones retained the parental vlsE sequence at 28 days. In contrast, the decrease in the number of clones with the parental vlsE sequence and the increase in the number of sequence changes occurred more gradually in severe combined immunodeficiency (SCID) mice. Clones containing a stop codon were isolated, indicating that continuous expression of full-length VlsE is not required for survival in vivo; also, these clones continued to undergo vlsE recombination. Analysis of clones with apparent single recombination events indicated that recombinations into vlsE are nonselective with regard to the silent cassette utilized, as well as the length and location of the recombination event. Sequence changes as small as one base pair were common. Fifteen percent of recovered vlsE variants contained “template-independent” sequence changes, which clustered in the variable regions of vlsE. We hypothesize that the increased frequency and complexity of vlsE sequence changes observed in clones recovered from immunocompetent mice (as compared with SCID mice) is due to rapid clearance of relatively invariant clones by variable region-specific anti-VlsE antibody responses

Central Role of the Holliday Junction Helicase RuvAB in vlsE Recombination and Infectivity of Borrelia burgdorferi

Antigenic variation plays a vital role in the pathogenesis of many infectious bacteria and protozoa including Borrelia burgdorferi, the causative agent of Lyme disease. VlsE, a 35 kDa surface-exposed lipoprotein, undergoes antigenic variation during B. burgdorferi infection of mammalian hosts, and is believed to be a critical mechanism by which the spirochetes evade immune clearance. Random, segmental recombination between the expressed vlsE gene and adjacent vls silent cassettes generates a large number of different VlsE variants within the infected host. Although the occurrence and importance of vlsE sequence variation is well established, little is known about the biological mechanism of vlsE recombination. To identify factors important in antigenic variation and vlsE recombination, we screened transposon mutants of genes known to be involved in DNA recombination and repair for their effects on infectivity and vlsE recombination. Several mutants, including those in BB0023 (ruvA), BB0022 (ruvB), BB0797 (mutS), and BB0098 (mutS-II), showed reduced infectivity in immunocompetent C3H/HeN mice. Mutants in ruvA and ruvB exhibited greatly reduced rates of vlsE recombination in C3H/HeN mice, as determined by restriction fragment polymorphism (RFLP) screening and DNA sequence analysis. In severe combined immunodeficiency (C3H/scid) mice, the ruvA mutant retained full infectivity; however, all recovered clones retained the ‘parental’ vlsE sequence, consistent with low rates of vlsE recombination. These results suggest that the reduced infectivity of ruvA and ruvB mutants is the result of ineffective vlsE recombination and underscores the important role that vlsE recombination plays in immune evasion. Based on functional studies in other organisms, the RuvAB complex of B. burgdorferi may promote branch migration of Holliday junctions during vlsE recombination. Our findings are consistent with those in the accompanying article by Dresser et al., and together these studies provide the first examples of trans-acting factors involved in vlsE recombination

Zeitaufgelöste Untersuchung der laser-induzierten Diffusion von CO-Molekülen auf gestuften Pt(111)-Oberflächen

In der vorliegenden Arbeit wurde die Dynamik von CO-Molekülen auf einer gestuften Pt(111)-Oberfläche unter Anregung mit einem fs-Laser bei tiefen Temperaturen mit laserspektroskopischen Methoden untersucht. Ausgenutzt wurde dabei die Sensitivität der optischen Methode der Frequenzverdopplung (SHG) auf Bedeckungsänderungen an den Stufenplätzen der Oberfläche. Es wurde gezeigt, dass die laser-induzierte Diffusion am CO/Pt(111)-System für die Anregung der Stufendiffusion erfolgreich durchgeführt und modelliert werden konnte. Die Experimente verdeutlichen, dass nicht nur die Reaktionsausbeute gesteuert werden konnte, sondern aus dem Durchführen zeitaufgelöster Messungen (Zweipuls-Korrelation) an diesem System eine Entschlüsselung der Energietransferprozesse geschehen konnte. Die gute Statistik der Daten hat dabei diese zeitaufgelöste Untersuchung, mit der Einsicht in den Transferprozess von der optischen Anregung zur Adsorbatbewegung genommen werden konnte, ermöglicht. Somit konnte das Potential der Methode voll ausgeschöpft werden und Transferzeiten im sub-ps-Bereich ermittelt werden. Zunächst wurde die Diffusion von CO-Molekülen von den Stufen- zu den Terrassenplätzen der Oberfläche untersucht. Mit der SHG an Oberflächen konnte das System dahingehend charakterisiert werden, dass mikroskopische Information über diesen speziellen Diffusionspfad extrahiert werden konnte. Es konnte gezeigt werden, dass durch das Dosieren bei erhöhter Substrattemperatur CO selektiv auf den Stufenplätzen adsorbiert werden kann, sodass durch die Auswertung eines für diese Plätze sensitiven SHG-Signals direkt eine Stufenentleerungsrate als Funktion sensitiver Laserparameter bestimmt werden konnte. Hierüber konnte eine Abhängigkeit etwa vom Laserfluss mit einem Exponenten von sechs bei Laserflüssen im Bereich einiger mJ/cm2, wie es in DIMET-Prozessen üblich ist, festgestellt werden. Die empfindliche Abhängigkeit der Hüpfrate vom Laserfluss eröffnete die Möglichkeit für Korrelationsmessungen, die sich in einer für elektronisch induzierte Prozesse charakteristischen schmalen Verteilung manifestierten. Die experimentell gefundene extrem kurze Energietransferzeit von 500 fs für diesen Prozess untermauert die Vermutung, dass der Prozess tatsächlich elektronisch induziert ist. Die zusätzlichen Freiheitsgrade des CO-Moleküls, die bei der Diffusion involviert werden können, wurden an dieser Stelle diskutiert und erweitern bisherige Studien aus unserer Arbeitsgruppe an elektronisch induzierter Diffusion atomarer Adsorbate. Im Folgenden wurde dargestellt, wie die experimentellen Ergebnisse modelliert wurden. Ein klassisches Modell mit konstanter Reibung reicht nicht aus, um die schmale Breite der Zweipuls-Korrelation zu beschreiben. Der schnelle Energietransfer, der aus diesen Messungen abgeleitet wurde, konnte erst im Rahmen des 3TM mit elektronischer, temperaturabhängiger Reibung modelliert und komplett verstanden werden. Der Prozess der Stufendiffusion konnte als klar elektronisch aktivierter Prozess mit einer Transferzeit von etwa 500 fs, die kürzer ist als alle vergleichbaren Desorptions- und Diffusionsexperimente, beschrieben werden. Dies erstaunt umso mehr, als dass die Flussabhängigkeit durchaus vergleichbar mit typischen Desorptionsexperimenten ausfällt. Schlüssig modelliert wurde dies - wobei für Flussabhängigkeit und zeitaufgelöste Messungen parallel der gleiche Satz an Parametern verwendet wurde - unter Verwendung eines Reibungskoeffizienten, der von der Elektronentemperatur abhängt. Des Weiteren wurde die Analyse um die CO-Terrassendiffusion erweitert. CO wurde dabei in kleinen Bedeckungen auf den Terrassen adsorbiert und die Diffusion als zeitliche Veränderung an den als Fallen dienenden Stufenplätzen detektiert. Für diesen niederenergetischen Prozess reichten Laserflüsse um 1 mJ/cm2 aus, um eine Anregung der Moleküle auf den Terrassen zu induzieren. Des Weiteren wurde ein schwächeres Anregungsschema mit einer quadratischen Abhängigkeit vom Laserfluss ermittelt. Die auch hier durchgeführte Zweipuls-Korrelation weist ebenfalls auf einen elektronisch induzierten Prozess hin. Bei einer Substrattemperatur von 40 K spricht die Kreuzkorrelation, aus der eine Energietransferzeit von 1.8 ps ermittelt wurde, für einen elektronisch induzierten Energietransfer. Abschließend lässt sich auch für diesen Diffusionspfad eine Besonderheit hervorheben: Mittels einer Beschreibung der Daten im Rahmen des 3TM konnten auch diese experimentellen Ergebnisse mit Modellierungen in Einklang gebracht werden, die dem im Fall der Stufendiffusion verwendeten Satz an Parametern mit modifizierter Energiebarriere entsprechen. Anhand dieser Simulationen im Rahmen der elektronischen Reibung, welche die Möglichkeit einer einfachen Modellierung multidimensionaler Phänomene bieten, wurden somit alle beobachteten Befunde in einer einheitlichen Beschreibung zusammengefasst

In Vivo Expression Technology Identifies a Novel Virulence Factor Critical for Borrelia burgdorferi Persistence in Mice

Analysis of the transcriptome of Borrelia burgdorferi, the causative agent of Lyme disease, during infection has proven difficult due to the low spirochete loads in the mammalian tissues. To overcome this challenge, we have developed an In Vivo Expression Technology (IVET) system for identification of B. burgdorferi genes expressed during an active murine infection. Spirochetes lacking linear plasmid (lp) 25 are non-infectious yet highly transformable. Mouse infection can be restored to these spirochetes by expression of the essential lp25-encoded pncA gene alone. Therefore, this IVET-based approach selects for in vivo-expressed promoters that drive expression of pncA resulting in the recovery of infectious spirochetes lacking lp25 following a three week infection in mice. Screening of approximately 15,000 clones in mice identified 289 unique in vivo-expressed DNA fragments from across all 22 replicons of the B. burgdorferi B31 genome. The in vivo-expressed candidate genes putatively encode proteins in various functional categories including antigenicity, metabolism, motility, nutrient transport and unknown functions. Candidate gene bbk46 on essential virulence plasmid lp36 was found to be highly induced in vivo and to be RpoS-independent. Immunocompetent mice inoculated with spirochetes lacking bbk46 seroconverted but no spirochetes were recovered from mouse tissues three weeks post inoculation. However, the bbk46 gene was not required for B. burgdorferi infection of immunodeficient mice. Therefore, through an initial IVET screen in B. burgdorferi we have identified a novel in vivo-induced virulence factor critical for the ability of the spirochete to evade the humoral immune response and persistently infect mice