Etude phénotypique des cellules endométriosiques profondes

L endométriose concerne 8 à 10% des femmes en âge de procréer et est responsable de douleurs pelviennes chroniques et d infertilité. Seule l exérèse chirurgicale des lésions permet un traitement curatif de la maladie. Dans le cas de l endométriose profonde avec atteinte rectale la chirurgie est extensive et associée à une morbidité significative. Les traitements médicaux reposent sur une hormonothérapie visant à bloquer la fonction ovarienne dont l effet n est que suspensif et transitoire. Il n existe à ce jour aucun traitement ciblant les mécanismes à l origine de la maladie. L objectif de notre travail était d explorer différents mécanismes potentiellement impliqués dans le développement de la maladie et d identifier des molécules capables d intervenir sur ces mécanismes. Dans un premier temps nous avons exploré le phénotype hyperprolifératif des cellules endométriosiques profondes et cherché un lien avec différentes voies métaboliques impliquées dans la prolifération cellulaire telles que le stress oxydant, la voie ERK et la voie Akt. Dans un deuxième temps, nous avons exploré le recrutement des cellules endométriales au sein de la cavité péritonéale au travers de l interaction CXCR4-CXCL12. Des cultures cellulaires ont été réalisées à partir de prélèvements humains de nodules endométriosiques profonds, d endomètre eutopique et d endomètre sain. Des lames histologiques ont été préparées à partir de nodules endométriosiques profonds. Des prélèvements de liquide péritonéal de femmes endométriosiques et de témoins ont été congelés. La prolifération cellulaire a été étudiée par incorporation de thymidine tritiée. La production des FRO a été évaluée par spectrofluorimétrie. La voie ERK a été évaluée par western blot, ELISA et immunohistochimie. La voie Akt été évaluée par western blot et immunohistochimie. Nous avons montré un phénotype hyperprolifératif des cellules endométriosiques profondes en rapport avec une activation de la voie ERK par le biais du stress oxydant et à une activation de la voie Akt. Nous avons montré qu un anti-oxydant (NAC), un inhibiteur de protéines kinases (A771726), un inhibiteur de Raf (sorafenib), un inhibiteur de mTOR (temsirolimus), un agoniste des cannabinoïdes (WIN 55212-2) et un anti-métabolite (5-FU) pouvaient contôler la prolifération des cellules endométriosiques profondes in vitro et la progression de nodules endométriosiques profonds implantés dans des souris Nudes. L interaction CXCR4-CXCL12 a été étudiée par western blot, analyse de migration, cytométrie de flux et ELISA. Nous avons montré une attraction spécifique des cellules endométriosiques profondes sur-exprimant le CXCR4 par la chimiokine CXCL12 présente en quantité accrue dans le liquide péritonéal des femmes endométriosiques. En conclusion, nous avons montré que le traitement médical de l endométriose pouvait être non hormonal et que le stress oxydant, la voie ERK et la voie Akt constituaient de nouvelles pistes thérapeutiques à évaluer dans le cadre d essais cliniques. Nous avons également montré comment la modification constitutive des cellules de l endomètre eutopique pouvait favoriser leur recrutement dans la cavité péritonéale.Endometriosis, a common disease that affects approximately 8 to 10% of women of childbearing age, is responsible for chronic pelvic pain and infertility. There is currently no cure other than surgical removal of lesions. In the case of deep infiltrating endometriosis with rectal involvement, surgery is associated with a significant morbidity. Medical treatments are based on a hormone used to block ovarian function. Their effects are only transient and suspensive. There is currently no treatment targeting the mechanisms underlying the disease. The aim of our study was to explore different pathways potentially involved in the development of endometriosis and to identify molecules that act on these mechanisms. In a first step, we explored the hyperproliferative phenotype of deep infiltrating endometriosis cells and sought a link with different metabolic pathways involved in cell proliferation such as oxidative stress, ERK, and Akt pathways. In a second step, we explored the recruitment of endometrial cells in the peritoneal cavity through the CXCL12-CXCR4 interaction. Cell cultures were taken from deep infiltrating endometriosis nodules, eutopic endometrium and control endometrium. Histological slides were prepared from deep endometriotic nodules. Peritoneal fluid of women with deep infiltrating endometriosis, and of women without endometriosis were frozen. Cell proliferation was determined by [H3]thymidine incorporation. Cellular production of ROS was assessed by spectrofluorometry. ERK pathway was assessed by Western blot, ELISA assay and immunohistochemistry. The Akt pathway was assessed by Western blot and immunohistochemistry. We showed a hyperproliferative phenotype of deep infiltrating endometriosis cells in line with an activation of the ERK pathway through an up-regulation of oxidative stress, and activation of the Akt pathway. We have shown that an antioxidant (NAC), an inhibitor of protein kinases (A771726), a Raf inhibitor (sorafenib), an inhibitor of mTOR (temsirolimus), a cannabinoid agonist (WIN 55212-2) and an anti-metabolite (5-FU) could control the proliferation of endometriotic cells in vitro, and the growth of endometriotic nodules grafted in Nude mice. The CXCL12-CXCR4 interaction was studied by Western blot, Transwell migration assay, flow cytometry and ELISA assay. We showed a specific attraction of deep infiltrating endometriosis cells over-expressing the CXCR4 chemokine by CXCL12 present in increased amounts in the peritoneal fluid of endometriotic women. In conclusion, we have shown that medical treatment of endometriosis could be non-hormonal and that oxidative stress, ERK and Akt were new therapeutic approaches to assess in clinical trials. We also showed how the molecular changes of eutopic endometrial cells could facilitate their recruitment into the peritoneal cavity.PARIS5-Bibliotheque electronique (751069902) / SudocSudocFranceF

Mangafodipir Protects against Hepatic Ischemia-Reperfusion Injury in Mice

Mangafodipir is a contrast agent used in magnetic resonance imaging that concentrates in the liver and displays pleiotropic antioxidant properties. Since reactive oxygen species are involved in ischemia-reperfusion damages, we hypothesized that the use of mangafodipir could prevent liver lesions in a mouse model of hepatic ischemia reperfusion injury. Mangafodipir (MnDPDP) was compared to ischemic preconditioning and intermittent inflow occlusion for the prevention of hepatic ischemia-reperfusion injury in the mouse.Mice were subjected to 70% hepatic ischemia (continuous ischemia) for 90 min. Thirty minutes before the ischemic period, either mangafodipir (10 mg/kg) or saline was injected intraperitoneally. Those experimental groups were compared with one group of mice preconditioned by 10 minutes' ischemia followed by 15 minutes' reperfusion, and one group with intermittent inflow occlusion. Hepatic ischemia-reperfusion injury was evaluated by measurement of serum levels of aspartate aminotransferase (ASAT) activity, histologic analysis of the livers, and determination of hepatocyte apoptosis (cytochrome c release, caspase 3 activity). The effect of mangafodipir on the survival rate of mice was studied in a model of total hepatic ischemia.<0.01), and by higher rates of survival in treated than in untreated animals (P<0.001). The level of protection by mangafodipir was similar to that observed following intermittent inflow occlusion and higher than after ischemic preconditioning.Mangafodipir is a potential new preventive treatment for hepatic ischemia-reperfusion injury

Hyperproliferative Phenotype of Deep Infiltrating Endometriosis Cells

L’endométriose concerne 8 à 10% des femmes en âge de procréer et est responsable de douleurs pelviennes chroniques et d’infertilité. Seule l’exérèse chirurgicale des lésions permet un traitement curatif de la maladie. Dans le cas de l’endométriose profonde avec atteinte rectale la chirurgie est extensive et associée à une morbidité significative. Les traitements médicaux reposent sur une hormonothérapie visant à bloquer la fonction ovarienne dont l’effet n’est que suspensif et transitoire. Il n’existe à ce jour aucun traitement ciblant les mécanismes à l’origine de la maladie. L’objectif de notre travail était d’explorer différents mécanismes potentiellement impliqués dans le développement de la maladie et d’identifier des molécules capables d’intervenir sur ces mécanismes. Dans un premier temps nous avons exploré le phénotype hyperprolifératif des cellules endométriosiques profondes et cherché un lien avec différentes voies métaboliques impliquées dans la prolifération cellulaire telles que le stress oxydant, la voie ERK et la voie Akt. Dans un deuxième temps, nous avons exploré le recrutement des cellules endométriales au sein de la cavité péritonéale au travers de l’interaction CXCR4-CXCL12. Des cultures cellulaires ont été réalisées à partir de prélèvements humains de nodules endométriosiques profonds, d’endomètre eutopique et d’endomètre sain. Des lames histologiques ont été préparées à partir de nodules endométriosiques profonds. Des prélèvements de liquide péritonéal de femmes endométriosiques et de témoins ont été congelés. La prolifération cellulaire a été étudiée par incorporation de thymidine tritiée. La production des FRO a été évaluée par spectrofluorimétrie. La voie ERK a été évaluée par western blot, ELISA et immunohistochimie. La voie Akt été évaluée par western blot et immunohistochimie. Nous avons montré un phénotype hyperprolifératif des cellules endométriosiques profondes en rapport avec une activation de la voie ERK par le biais du stress oxydant et à une activation de la voie Akt. Nous avons montré qu’un anti-oxydant (NAC), un inhibiteur de protéines kinases (A771726), un inhibiteur de Raf (sorafenib), un inhibiteur de mTOR (temsirolimus), un agoniste des cannabinoïdes (WIN 55212-2) et un anti-métabolite (5-FU) pouvaient contôler la prolifération des cellules endométriosiques profondes in vitro et la progression de nodules endométriosiques profonds implantés dans des souris Nudes. L’interaction CXCR4-CXCL12 a été étudiée par western blot, analyse de migration, cytométrie de flux et ELISA. Nous avons montré une attraction spécifique des cellules endométriosiques profondes sur-exprimant le CXCR4 par la chimiokine CXCL12 présente en quantité accrue dans le liquide péritonéal des femmes endométriosiques. En conclusion, nous avons montré que le traitement médical de l’endométriose pouvait être non hormonal et que le stress oxydant, la voie ERK et la voie Akt constituaient de nouvelles pistes thérapeutiques à évaluer dans le cadre d’essais cliniques. Nous avons également montré comment la modification constitutive des cellules de l’endomètre eutopique pouvait favoriser leur recrutement dans la cavité péritonéale.Endometriosis, a common disease that affects approximately 8 to 10% of women of childbearing age, is responsible for chronic pelvic pain and infertility. There is currently no cure other than surgical removal of lesions. In the case of deep infiltrating endometriosis with rectal involvement, surgery is associated with a significant morbidity. Medical treatments are based on a hormone used to block ovarian function. Their effects are only transient and suspensive. There is currently no treatment targeting the mechanisms underlying the disease. The aim of our study was to explore different pathways potentially involved in the development of endometriosis and to identify molecules that act on these mechanisms. In a first step, we explored the hyperproliferative phenotype of deep infiltrating endometriosis cells and sought a link with different metabolic pathways involved in cell proliferation such as oxidative stress, ERK, and Akt pathways. In a second step, we explored the recruitment of endometrial cells in the peritoneal cavity through the CXCL12-CXCR4 interaction. Cell cultures were taken from deep infiltrating endometriosis nodules, eutopic endometrium and control endometrium. Histological slides were prepared from deep endometriotic nodules. Peritoneal fluid of women with deep infiltrating endometriosis, and of women without endometriosis were frozen. Cell proliferation was determined by [H3]thymidine incorporation. Cellular production of ROS was assessed by spectrofluorometry. ERK pathway was assessed by Western blot, ELISA assay and immunohistochemistry. The Akt pathway was assessed by Western blot and immunohistochemistry. We showed a hyperproliferative phenotype of deep infiltrating endometriosis cells in line with an activation of the ERK pathway through an up-regulation of oxidative stress, and activation of the Akt pathway. We have shown that an antioxidant (NAC), an inhibitor of protein kinases (A771726), a Raf inhibitor (sorafenib), an inhibitor of mTOR (temsirolimus), a cannabinoid agonist (WIN 55212-2) and an anti-metabolite (5-FU) could control the proliferation of endometriotic cells in vitro, and the growth of endometriotic nodules grafted in Nude mice. The CXCL12-CXCR4 interaction was studied by Western blot, Transwell migration assay, flow cytometry and ELISA assay. We showed a specific attraction of deep infiltrating endometriosis cells over-expressing the CXCR4 chemokine by CXCL12 present in increased amounts in the peritoneal fluid of endometriotic women. In conclusion, we have shown that medical treatment of endometriosis could be non-hormonal and that oxidative stress, ERK and Akt were new therapeutic approaches to assess in clinical trials. We also showed how the molecular changes of eutopic endometrial cells could facilitate their recruitment into the peritoneal cavity

Etude phénotypique des cellules endométriosiques profondes

Endometriosis, a common disease that affects approximately 8 to 10% of women of childbearing age, is responsible for chronic pelvic pain and infertility. There is currently no cure other than surgical removal of lesions. In the case of deep infiltrating endometriosis with rectal involvement, surgery is associated with a significant morbidity. Medical treatments are based on a hormone used to block ovarian function. Their effects are only transient and suspensive. There is currently no treatment targeting the mechanisms underlying the disease. The aim of our study was to explore different pathways potentially involved in the development of endometriosis and to identify molecules that act on these mechanisms. In a first step, we explored the hyperproliferative phenotype of deep infiltrating endometriosis cells and sought a link with different metabolic pathways involved in cell proliferation such as oxidative stress, ERK, and Akt pathways. In a second step, we explored the recruitment of endometrial cells in the peritoneal cavity through the CXCL12-CXCR4 interaction. Cell cultures were taken from deep infiltrating endometriosis nodules, eutopic endometrium and control endometrium. Histological slides were prepared from deep endometriotic nodules. Peritoneal fluid of women with deep infiltrating endometriosis, and of women without endometriosis were frozen. Cell proliferation was determined by [H3]thymidine incorporation. Cellular production of ROS was assessed by spectrofluorometry. ERK pathway was assessed by Western blot, ELISA assay and immunohistochemistry. The Akt pathway was assessed by Western blot and immunohistochemistry. We showed a hyperproliferative phenotype of deep infiltrating endometriosis cells in line with an activation of the ERK pathway through an up-regulation of oxidative stress, and activation of the Akt pathway. We have shown that an antioxidant (NAC), an inhibitor of protein kinases (A771726), a Raf inhibitor (sorafenib), an inhibitor of mTOR (temsirolimus), a cannabinoid agonist (WIN 55212-2) and an anti-metabolite (5-FU) could control the proliferation of endometriotic cells in vitro, and the growth of endometriotic nodules grafted in Nude mice. The CXCL12-CXCR4 interaction was studied by Western blot, Transwell migration assay, flow cytometry and ELISA assay. We showed a specific attraction of deep infiltrating endometriosis cells over-expressing the CXCR4 chemokine by CXCL12 present in increased amounts in the peritoneal fluid of endometriotic women. In conclusion, we have shown that medical treatment of endometriosis could be non-hormonal and that oxidative stress, ERK and Akt were new therapeutic approaches to assess in clinical trials. We also showed how the molecular changes of eutopic endometrial cells could facilitate their recruitment into the peritoneal cavity.L’endométriose concerne 8 à 10% des femmes en âge de procréer et est responsable de douleurs pelviennes chroniques et d’infertilité. Seule l’exérèse chirurgicale des lésions permet un traitement curatif de la maladie. Dans le cas de l’endométriose profonde avec atteinte rectale la chirurgie est extensive et associée à une morbidité significative. Les traitements médicaux reposent sur une hormonothérapie visant à bloquer la fonction ovarienne dont l’effet n’est que suspensif et transitoire. Il n’existe à ce jour aucun traitement ciblant les mécanismes à l’origine de la maladie. L’objectif de notre travail était d’explorer différents mécanismes potentiellement impliqués dans le développement de la maladie et d’identifier des molécules capables d’intervenir sur ces mécanismes. Dans un premier temps nous avons exploré le phénotype hyperprolifératif des cellules endométriosiques profondes et cherché un lien avec différentes voies métaboliques impliquées dans la prolifération cellulaire telles que le stress oxydant, la voie ERK et la voie Akt. Dans un deuxième temps, nous avons exploré le recrutement des cellules endométriales au sein de la cavité péritonéale au travers de l’interaction CXCR4-CXCL12. Des cultures cellulaires ont été réalisées à partir de prélèvements humains de nodules endométriosiques profonds, d’endomètre eutopique et d’endomètre sain. Des lames histologiques ont été préparées à partir de nodules endométriosiques profonds. Des prélèvements de liquide péritonéal de femmes endométriosiques et de témoins ont été congelés. La prolifération cellulaire a été étudiée par incorporation de thymidine tritiée. La production des FRO a été évaluée par spectrofluorimétrie. La voie ERK a été évaluée par western blot, ELISA et immunohistochimie. La voie Akt été évaluée par western blot et immunohistochimie. Nous avons montré un phénotype hyperprolifératif des cellules endométriosiques profondes en rapport avec une activation de la voie ERK par le biais du stress oxydant et à une activation de la voie Akt. Nous avons montré qu’un anti-oxydant (NAC), un inhibiteur de protéines kinases (A771726), un inhibiteur de Raf (sorafenib), un inhibiteur de mTOR (temsirolimus), un agoniste des cannabinoïdes (WIN 55212-2) et un anti-métabolite (5-FU) pouvaient contôler la prolifération des cellules endométriosiques profondes in vitro et la progression de nodules endométriosiques profonds implantés dans des souris Nudes. L’interaction CXCR4-CXCL12 a été étudiée par western blot, analyse de migration, cytométrie de flux et ELISA. Nous avons montré une attraction spécifique des cellules endométriosiques profondes sur-exprimant le CXCR4 par la chimiokine CXCL12 présente en quantité accrue dans le liquide péritonéal des femmes endométriosiques. En conclusion, nous avons montré que le traitement médical de l’endométriose pouvait être non hormonal et que le stress oxydant, la voie ERK et la voie Akt constituaient de nouvelles pistes thérapeutiques à évaluer dans le cadre d’essais cliniques. Nous avons également montré comment la modification constitutive des cellules de l’endomètre eutopique pouvait favoriser leur recrutement dans la cavité péritonéale

Résultats fonctionnels du traitement chirurgical de l'endométriose rectale

PARIS7-Villemin (751102101) / SudocPARIS-BIUM (751062103) / SudocSudocFranceF

Increased Serum Oxidative Stress Markers in Women with Uterine Leiomyoma

<div><p>Background</p><p>Uterine leiomyomas (fibroids) are the most common gynaecological benign tumors in premenopausal women. Evidences support the role of oxidative stress in the development of uterine leiomyoma. We have analysed oxidative stress markers (thiols, advanced oxidized protein products (AOPP), protein carbonyls and nitrates/nitrites) in preoperative sera from women with histologically proven uterine leiomyoma.</p> <p>Methodology/Principal Findings</p><p>We conducted a laboratory study in a tertiary-care university hospital. Fifty-nine women with histologically proven uterine leiomyoma and ninety-two leiomyoma-free control women have been enrolled in this study. Complete surgical exploration of the abdominopelvic cavity was performed in each patient. Preoperative serum samples were obtained from all study participants to assay serum thiols, AOPP, protein carbonyls and nitrates/nitrites.</p> <p>Concentrations of serum protein carbonyl groups and AOPP were higher in leiomyoma patients than in the control group (p=0.005 and p<0.001, respectively). By contrast, serum thiol levels were lower in leiomyoma patients (p<0.001). We found positive correlations between serum AOPP concentrations and total fibroids weight (r=0.339; p=0.028), serum AOPP and serum protein carbonyls with duration of infertility (r=0.762; p=0.006 and r=0.683; p=0.021, respectively).</p> <p>Conclusions/Significance</p><p>This study, for the first time, reveals a significant increase of protein oxidative stress status and reduced antioxidant capacity in sera from women with uterine leiomyoma.</p> </div

Serum oxidative stress parameters in women with uterine leiomyoma and in controls.

<p><b>A</b>) Serum Thiols (µmol/l). <b>B</b>) Serum AOPP (µmol/l). <b>C</b>) Serum protein carbonyls (nmol/mg). <b>D</b>) Serum Nitrates/Nitrites (µmol/l). Statistical analysis was performed using the Mann-Whitney U. Serum oxidative stress parameters are represented as boxes and whisker plots. The bottom and top of the boxes represent the interquartile range (the 25th and 75th percentile, respectively), and the band near the middle of the box is the median. The ends of the whiskers represent the minimum and maximum of all the data. P < 0.05 was considered statistically significant.</p

Correlation between serum oxidative stress parameters and anatomical parameters of uterine leiomyoma.

<p><b>A</b>) Serum AOPP levels and Total Fibroids Weight (g), <b>B</b>) Serum AOPP levels and infertility duration, <b>C</b>) Serum Protein Carbonyl levels and infertility duration. Nonparametric Spearman’s correlation test was used to assess correlations.</p

Increasing the survival rate of mice by mangafodipir following reperfusion injury of the liver.

*<p>Animal survival was evaluated using the model of total hepatic ischemia (37).</p><p>The rate of mouse survival was evaluated in control group (90 minutes of ischemia; n = 9) and in control group with intraperitoneal administration of 10 mg/kg of mangafodipir 30 minutes prior to ischemia (n = 9) <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0027005#pone.0027005-Yadav1" target="_blank">[40]</a>. For the survival time courses, animals were sacrificed when they appeared moribund.</p

Prevention of glutathione depletion in the mitochondria (A) and in the cytoplasm (B) of hepatocytes following reperfusion injury.

<p>The concentrations of glutathione in cytoplasm and mitochondria of mouse liver were measured spectrophotometrically in whole liver homogenates. The levels of reduced gluthatione were expressed as pmol per 10 µg of proteins. Bars represent means ± SEM, nine mice in each group. The O2°- depletion in the mitochondria (C) of HepG2 cells induced by mangafodipir (400 µM) was assessed in a kinetic experiment. Immunofluorescence microscopy of HepG2 cells stained with oxidation of dihydroethidium (DHE) and treated for 18 h or not with mangafodipir. (D–E) A decreased intensity of cytosol with mangafodipir in mangafodipir treated cells was observed.</p