A New Genetic Locus in \u3ci\u3eSinorhizobium meliloti\u3c/i\u3e is Involved in Stachydrine Utilization

Stachydrine, a betaine released by germinating alfalfa seeds, functions as an inducer of nodulation genes, a catabolite, and an osmoprotectant in Sinorhizobium meliloti. Two stachydrine-inducible genes were found in S. meliloti 1021 by mutation with a Tn5-luxAB promoter probe. Both mutant strains (S10 and S11) formed effective alfalfa root nodules, but neither grew on stachydrine as the sole carbon and nitrogen source. When grown in the absence or presence of salt stress, S10 and S11 took up [14C]stachydrine as well as wild-type cells did, but neither used stachydrine effectively as an osmoprotectant. In the absence of salt stress, both S10 and S11 took up less [14C]proline than wild-type cells did. S10 and S11 appeared to colonize alfalfa roots normally in single-strain tests, but when mixed with the wild- type strain, their rhizosphere counts were reduced more than 50% (P ≤ 0.01) relative to the wild type. These results suggest that stachydrine catabolism contributes to root colonization. DNA sequence analysis identified the mutated locus in S11 as putA, and the luxAB fusion in that gene was induced by proline as well as stachydrine. DNA that restored the capacity of mutant S10 to catabolize stachydrine contained a new open reading frame, stcD. All data are consistent with the concept that stcD codes for an enzyme that produces proline by demethylation of N-methylproline, a degradation product of stachydrine

Mécanismes de l'accumulation des bétaïnes en réponse au stress osmotique chez Sinorhizobium meliloti en culture libre et lors de la symbiose avec Medicago sativa (importance du transporteur de bétaïnes, BetS)

Les recherches menées au laboratoire portent sur l'adaptation de la symbiose S. meliloti-M. sativa aux contraintes osmotiques en considérant à la fois le partenaire bactérien et la plante hôte. Il est bien établi que la croissance de S. meliloti, fortement inhibée en milieu de forte osmolarité, est restaurée de manière spectaculaire par un apport exogène de glycine bétaïne (GB) ou de proline bétaïne (PB). Au cours de mon travail de thèse, je me suis attaché à identifier et à caractériser un transporteur de bétaïnes, nommé BetS. Ce système, de type BCCT (Betaine Choline Carnitine Transporter), est un symport Na+-dépendant, exprimé de façon constitutive et soumis à une régulation post-traductionnelle par l'osmolarité du milieu. Le phénotype d'un mutant betS a été analysé. Il apparaît clairement que BetS joue un rôle majeur dans les premières étapes de l'adaptation de S. meliloti à un stress osmotique (1). Une série de mutants de délétions des extrémités N- et C- terminales cytoplasmiques du transporteur a été réalisée afin de déterminer le rôle de ces régions dans la perception du stress osmotique. Les résultats indiquent que l'extrémité C-terminale joue un rôle primordial dans la structure et/ou le fonctionnement du système. En parallèle, les mécanismes d'adaptation de la luzerne au stress salin ont été analysés. Cette légumineuse, soumise à une salinité élevée (NaCl 0,2 M) accumule dans les différents organes (tige, racine et nodosité) de la proline et de la PB. La PB est synthétisée, dans les tiges, à partir de la proline et son catabolisme est fortement inhibé à forte osmolarité. Des modifications importantes de la structure du symbiosome et de la teneur en Na+ et K+ sont observées dans le bactéroïde qui accumule la proline et la PB en condition de stress. La PB est transportée à travers la membrane péribactéroïdienne et par les bactéroïdes via le système BetS qui contribue à l'accumulation de cette bétaïne (2). L'utilisation d'une fusion betS-lacZ et des mesures de transport réalisées sur des bactéroïdes isolés ont montré que le gène betS est exprimé au cours des différentes étapes du développement de la nodosité et que le transporteur BetS est fonctionnel dans les nodosités matures. Un mutant du gène betS n'est cependant pas altéré dans son phénotype symbiotique. En revanche, des bactéroïdes issus d'une souche surexprimant le gène betS accumulent la PB plus rapidement que ceux issus de la souche sauvage. Ce résultat est corrélé au maintien de l'activité fixatrice d'azote à un niveau élevé après 7 jours de stress, alors que cette activité chute de 50 % chez les bactéroïdes issus de la souche sauvage. Cependant, la surproduction n'apporte plus d'avantage après 14 jours de stress. Ces résultats indiquent un rôle bénéfique important de la PB, mais limité à la phase initiale de réponse au stress. En outre, le gène betS a été introduit chez Bradyrhizobium japonicum, souche d'intérêt agronomique nodulant le soja (Glycine max), mais très sensible au stress salin. L'expression du gène betS confère à B. japonicum la capacité d'accumuler la GB et la PB et de croître en présence de 80 mM de NaCl, lorsque ces composés sont disponibles dans le milieu, alors que la croissance de la souche sauvage est complètement inhibée dans les mêmes conditions. Des systèmes d'efflux de cette bétaïne permettent spontanément de relarguer la GB lors d'un retour à des conditions de faible osmolarité. Cependant, l'introduction du gène betS ne restaure pas la croissance de la souche complémentée lorsque la concentration en NaCl est de 100 mM. L'hypothèse d'une toxicité de l'ion Na+, liée à l'absence apparente d'échangeur Na+/H+, est discutée (3).NICE-BU Sciences (060882101) / SudocSudocFranceF

Cloning and characterization of a fur homologue from Azospirillum brasilense Sp7

International audienc

Osmoprotection mechanisms in rhizobia isolated from Vicia faba var. major and Cicer arietinum

Research of mechanisms involved in osmoprotection of two rhizobia strains isolated from nodules of Vicia faba var. major and one strain nodulating Cicer arietinum, showed that choline and glycine-betaine improved growth in salt stress conditions. Provided radioactive choline was converted into glycine betaine catabolized at low osmolarity and accumulated under osmotic stress. Enzyme activities involved in the synthesis of glycine betaine from choline were not modified by salt whereas addition of choline to the growth medium enhanced them. Exogenous radioactive glycine betaine was accumulated in salt stressed bacteria after one hour incubation but catabolized four hours later, suggesting a transient accumulation. Growth experiments indicated that betaine and its derivatives could be used as nitrogen and carbon sources. An investigation, by liquid phase chromatography, revealated accumulation of glutamate and alanine at different levels according to the strain and degree of stress.Mécanismes d'osmoprotection chez les rhizobia isolés de Vicia faba var. major et de Cicer arietinum. La recherche des mécanismes impliqués dans l'osmoprotection chez deux souches de rhizobium isolées des nodosités de Vicia faba var. major et une souche nodulant Cicer arietinum, a montré que la glycine bétaïne et la choline améliorent la croissance bactérienne sous stress salin. Lors d'études métaboliques, la choline intracellulaire radioactive est transformée en glycine bétaïne et ce indépendamment de l'osmolarité du milieu. En effet, les activités choline déshydrogénase et glycine bétaïne aldéhyde déshydrogénase ne sont pas modifiées par le sel. Néanmoins, la présence de la choline dans le milieu augmente les deux activités enzymatiques. L'incubation en présence de la glycine bétaïne durant une heure est suivie d'une accumulation de ce composé chez les cellules cultivées à 0,15 M NaCl. Cette accumulation n'a plus lieu quatre heures plus tard. Des expériences de croissance avec la glycine bétaïne ou ses métabolites montrent son utilisation comme source de carbone et d'azote. La recherche, par chromatographie en phase liquide a révélé l'accumulation du glutamate et de l'alanine à des niveaux variables en fonction de la souche et du degré de stress

Proline Betaine Uptake in Sinorhizobium meliloti: Characterization of Prb, an Opp-Like ABC Transporter Regulated by both Proline Betaine and Salinity Stress

Sinorhizobium meliloti uses proline betaine (PB) as an osmoprotectant when osmotically stressed and as an energy source in low-osmolarity environments. To fulfill this dual function, two separate PB transporters, BetS and Hut, that contribute to PB uptake at high and low osmolarity, respectively, have been previously identified. Here, we characterized a novel transport system that mediates the uptake of PB at both high and low osmolarities. Sequence analysis of Tn5-luxAB chromosomal insertions from several PB-inducible mutants has revealed the presence of a four-gene locus encoding the components of an ABC transporter, Prb, which belongs to the oligopeptide permease (Opp) family. Surprisingly, prb mutants were impaired in their ability to transport PB, and oligopeptides were not shown to be competitors for PB uptake. Further analysis of Prb specificity has shown its ability to take up other quaternary ammonium compounds such as choline and, to a lesser extent, glycine betaine. Interestingly, salt stress and PB were found to control prb expression in a positive and synergistic way and to increase Prb transport activity. At low osmolarity, Prb is largely implicated in PB uptake by stationary-phase cells, likely to provide PB as a source of carbon and nitrogen. Furthermore, at high osmolarity, the analysis of prb and betS single and double mutants demonstrated that Prb, together with BetS, is a key system for protection by PB

Overexpression of BetS, a Sinorhizobium meliloti high-affinity betaine transporter, in bacteroids from Medicago sativa nodules sustains nitrogen fixation during early salt stress adaptation

International audienc