Fraktionierung der stabilen Kohlenstoffisotope in der Steroid-Biosynthese durch 3-Hydroxy-3-methylglutaryl Coenzym A Reduktase

Stabile Kohlenstoffisotope zeigen in natürlichen Materialien eine nicht-statistische Verteilung. Vergleicht man die Isotopenverhältnisse unterschiedlicher chemischer Verbindungen, können Aussagen über Stoffquellen und Biosynthesewege getroffen werden. Die Isotopenverhältnisse hängen von biosynthetischen Prozessen ab, die eine 13C/12CFraktionierung verursachen können. Im Falle der Lipide beobachtet man typischerweise eine deutliche 13C-Abreicherung gegenüber dem 13C/12C-Verhältnis der gesamten Biomasse eines Organismus. Allerdings zeigen die humane Steroidhormone, die eine Untergruppe der Lipide darstellen, nur eine geringe 13C-Abreicherung gegenüber der Biomasse. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, zum Verständnis dieses speziellen Phänomens beizutragen. Im Metabolismus kann ein kinetischer Isotopeneffekt nur eine Isotopenfraktionierung verursachen, wenn eine unvollständige Umsetzung des Substrats stattfindet oder sich der Biosyntheseweg verzweigt. Daher wurde hier eine Enzymreaktion betrachtet, die als der limitierende Schritt des Mevalonatbiosynthesewegs, aus dem unter anderem die Steroide hervorgehen, gilt. Die katalytische Domäne der humanen 3-Hydroxy-3-methylglutaryl Coenzym A Reduktase (HMGR) wurde bakteriell exprimiert und gereinigt. Während der enzymatischen Umsetzung des eingesetzten Substrats wurden in bestimmten Zeitabständen Proben aus der Reaktionslösung entnommen. Aus den Proben wurde das Reaktionsprodukt isoliert und mittels Gaschromatographie-gekoppelter Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie analysiert. Für die Abhängigkeit zwischen dem Isotopenverhältnis und dem Zeitpunkt der Probennahme wurde in dieser Arbeit ein mathematisches Modell entwickelt und eine Kurvenanpassung an die Messwerte durchgeführt. Für die in vitro HMGR-Reaktion ergab sich ein durchschnittlicher Fraktionierungsfaktor 12k/13k von 1,0031 mit einer Standardabweichung von 0,0004 für alle Kohlenstoffatome im analysierten Produktmolekül. Der mögliche Einfluss der HMGR-Reaktion auf das Isotopenverhältnis der Steroide wird diskutiert