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Quantification des contraintes nutritionnelles et\ud métaboliques associées à la production de gomme xanthane\ud par Xanthomonas campestris
La production industrielle de gomme xanthane, polysaccharide présentant des caractéristiques rhéologiques\ud
exceptionnelles, est réalisée en cultures discontinues aérobies de Xanthomonas campestris, Le travail présenté\ud
dans cette thèse évalue l'influence des paramètres environnementaux et physiologiques sur la biosynthèse de la\ud
gomme dans le cadre d'un procédé industriel.\ud
L'analyse macro-cinétique de la production de xanthane sur saccharose montre une phase de croissance rapide\ud
suivie d'une phase de ralentissement à laquelle est associée une diminution de l'ensemble des vitesses\ud
spécifiques. Ce phénomène, provoqué par des modifications de l'environnement nutritionnel, s'accompagne de\ud
l'augmentation progressive du rendement instantané en xanthane et de la diminution de la teneur en pyruvate\ud
dans la gomme.\ud
Les performances de production de xanthane ont été ensuite quantifiées sur d'autres sources de carbone,\ud
exploitables à l'échelle industrielle. Parmi celles-ci, le saccharose permet d'atteindre les performances de\ud
production les plus intéressantes, qui se caractérisent par des vitesses élevées sans diminution significative du\ud
rendement en polysaccharide. Par contre, l'étude cinétique sur glucose montre des vitesses plus faibles que sur\ud
saccharose, qui peuvent s'expliquer par une limitation du flux d'entrée dans la cellule. L'utilisation du glucose\ud
comme source de carbone s'avère donc être une stratégie très pénalisante pour les performances du procédé.\ud
Ces résultats macroscopiques ont été utilisés pour évaluer, par une méthode de bilan matière, le(s) facteur(s)\ud
tnétabolique(s) qui influence(nt) le rendement de production de xanthane. Un rendement théorique est calculé en\ud
imposant différentes contraintes métaboliques: mode d'entrée du substrat, distribution du flux de\ud
glycéraldéhyde-3-phosphate entre le cycle des hexoses et la partie exergonique de la glycolyse et efficacité\ud
énergétique de la chaîne respiratoire. La comparaison du rendement calculé avec le rendement expérimental\ud
suggère que l'énergétique cellulaire est le principal facteur métabolique qui contrôle la biosynthèse du xanthane.\ud
L'optimisation des dépenses énergétiques est alors la condition primordiale à l'amélioration des rendements en\ud
polysaccharide.\ud
Une analyse biochimique intracellulaire qui s'appuie sur la caractérisation d'activités enzymatiques ex vivo et la\ud
détermination des contraintes métaboliques in vivo (concentrations en enzymes et en métabolites intracellulaires,\ud
etc.), a permis d'établir une distribution du flux de carbone et d'énergie dans le réseau métabolique de X\ud
campestris. Des modifications de l'orientation du flux de carbone sont visualisées en cours de culture. En\ud
particulier, le flux de glycéraldéhyde-3-phosphate est majoritairement orienté en début de culture vers la voie\ud
gluconéogénique puis, en fin de culture, il emprunte principalement la voie exergonique de la glycolyse et les\ud
voies génératrices d'énergie
A two-dimensional population balance model for cell growth including multiple uptake systems
Cell growth in a chemostat is a well-documented research topic. How cells uptake the avail-able substrate to gain weight and engage cell division is not generally taken into account inthe modelling bioreactors. In fact, the growth rate is related to a population doubling timewhereas the microorganisms’ growth in mass is due to the mass transfer of substrates fromthe liquid phase to the biotic phase. Clearly, growth in mass precedes growth in number.Similarly, the transport of substrates down to the cell scale precedes the mass transfer. Thisarticle’s main feature is a two-dimensional population balance model that allows to uncou-ple growth in mass and growth in number when the equilibrium between a cell populationand its environment is disrupted. The cell length and the rate of anabolism are chosen asinternal variables. It is proved that the hypothesis “growth in number = growth in mass” isvalid at steady-state or in exponential growth only. The glucose uptake is assumed drivenby two transport systems with a different affinity constant for the substrate. This combina-tion of two regulated uptake systems operating in parallel explains a 3-fold increase in theuptake following a glucose pulse, but can also predict substrate uptake rates higher thanthe maximal batch value as observed in some experiments. These features are obtainedby considering carbon fluxes in the formulation of regulation principles for uptake dynam-ics. The population balance’s implementation in a multi-compartment reactor is a naturalprospective work and allows extensions to industrial processes
Control of ATP homeostasis during the respiro-fermentative transition in yeast
Respiring Saccharomyces cerevisiae cells respond to a sudden increase in glucose concentration by a pronounced drop of their adenine nucleotide content. Transient accumulation of the purine salvage pathway intermediate inosine accounts for the apparent loss of adenine nucleotides.Inosine formation in response to perturbations of cellular energy balance depends on the presence of a fermentable carbon source. Under respiratory conditions, AMP accumulates instead and no inosine is formed.Conversion of AXPs into inosine is facilitated by AMP deaminase, Amd1, and IMP-specific 5'-nucleotidase, Isn1. Inosine recycling into the AXP pool is facilitated by the purine nucleoside phosphorylase, Pnp1, and joint action of the phosphoribosyltransferases, Hpt1 and Xpt1.Impaired inosine formation results in altered metabolite pool dynamics in response to glucose addition, but does not change glycolytic flux. However, mutants blocked in inosine formation exhibit delayed growth acceleration after glucose addition
Developmental stage-dependent metabolic regulation during meiotic differentiation in budding yeast
Quantification des flux métaboliques en condition dynamique : enjeux et stratégies expérimentales
International audienceL’analyse des flux métaboliques (MFA) vise à déterminer l’activité des voies métaboliques par la mesure des vitesses réelles de l’ensemble des réactions biochimiques se déroulant au sein d’une cellule ou d’un organisme (fluxomique). Plus généralement, la MFA permet de caractériser le fonctionnement du métabolisme et d’appréhender la réponse globale du métabolisme à une perturbation génétique ou environnementale. Du fait de l’extrême complexité des réseauxmétaboliques, des traceurs isotopiques (e.g. 13C, 15N) sont généralement utilisés pour révéler la distribution des flux au sein du métabolisme. En particulier, les approches de fluxomique parmarquage isotopique au 13C sont actuellement bien maîtrisées pour l’analyse de systèmes biologiques à l’état (pseudo)stationnaire. Cette condition conduit à des simplificationsexpérimentales (analyse du marquage des produits terminaux du métabolisme) et mathématiques au niveau des modèles de calcul des flux (réductions des équations à des systèmes linéaires). Néanmoins, ces approches présentent de nombreuses limites: i) elles ne correspondent pas à la réalité biologique puisque les systèmes biologiques sont soumis à de perpétuels changements de leur environnement, ii) un état stationnaire est parfois long et difficile (voire impossible) à obtenir iii) ces approches ne permettent pas de résoudre la distribution des flux pour toutes les configurations topologiques des réseaux métaboliques, iv) etc.La mesure des flux en régime dynamique est ainsi devenue un enjeu majeur en fluxomique, que ce soit pour appréhender sur un plan dynamique les réponses adaptatives du métabolisme (biologie intégrative) ou pour étendre le champ d’application de l’analyse des flux. Dans cette présentation, les principaux enjeux et verrous méthodologiques de la fluxomique en condition dynamique seront présentés. En pratique, les développements visant à la détermination des fluxmétaboliques dans ces conditions se situent à différents niveaux : i) nécessité de mesurer les marquages sur les intermédiaires métaboliques vrais, souvent instables et de demi-vie courte (méthodes d’échantillonnage, arrêt du métabolisme, stratégies analytiques adaptées), ii) disponibilité de systèmes expérimentaux adaptés (notamment aux échelles de temps du métabolisme), iii) disponibilité de modèles mathématiques nécessaire aux calculs des flux(système d’équations différentielles de grande taille). Au cours de cette présentation, ces différents aspects seront abordés et discutés sur la base de résultats obtenus au laboratoire
Quantification des flux métaboliques en condition dynamique : enjeux et stratégies expérimentales
International audienceL’analyse des flux métaboliques (MFA) vise à déterminer l’activité des voies métaboliques par la mesure des vitesses réelles de l’ensemble des réactions biochimiques se déroulant au sein d’une cellule ou d’un organisme (fluxomique). Plus généralement, la MFA permet de caractériser le fonctionnement du métabolisme et d’appréhender la réponse globale du métabolisme à une perturbation génétique ou environnementale. Du fait de l’extrême complexité des réseauxmétaboliques, des traceurs isotopiques (e.g. 13C, 15N) sont généralement utilisés pour révéler la distribution des flux au sein du métabolisme. En particulier, les approches de fluxomique parmarquage isotopique au 13C sont actuellement bien maîtrisées pour l’analyse de systèmes biologiques à l’état (pseudo)stationnaire. Cette condition conduit à des simplificationsexpérimentales (analyse du marquage des produits terminaux du métabolisme) et mathématiques au niveau des modèles de calcul des flux (réductions des équations à des systèmes linéaires). Néanmoins, ces approches présentent de nombreuses limites: i) elles ne correspondent pas à la réalité biologique puisque les systèmes biologiques sont soumis à de perpétuels changements de leur environnement, ii) un état stationnaire est parfois long et difficile (voire impossible) à obtenir iii) ces approches ne permettent pas de résoudre la distribution des flux pour toutes les configurations topologiques des réseaux métaboliques, iv) etc.La mesure des flux en régime dynamique est ainsi devenue un enjeu majeur en fluxomique, que ce soit pour appréhender sur un plan dynamique les réponses adaptatives du métabolisme (biologie intégrative) ou pour étendre le champ d’application de l’analyse des flux. Dans cette présentation, les principaux enjeux et verrous méthodologiques de la fluxomique en condition dynamique seront présentés. En pratique, les développements visant à la détermination des fluxmétaboliques dans ces conditions se situent à différents niveaux : i) nécessité de mesurer les marquages sur les intermédiaires métaboliques vrais, souvent instables et de demi-vie courte (méthodes d’échantillonnage, arrêt du métabolisme, stratégies analytiques adaptées), ii) disponibilité de systèmes expérimentaux adaptés (notamment aux échelles de temps du métabolisme), iii) disponibilité de modèles mathématiques nécessaire aux calculs des flux(système d’équations différentielles de grande taille). Au cours de cette présentation, ces différents aspects seront abordés et discutés sur la base de résultats obtenus au laboratoire
Analyse de la relation structure/fonction des systèmes métaboliques microbiens
International audienc
Analyse de la relation structure/fonction des systèmes métaboliques microbiens
International audienc
An intracellular metabolite quantification technique applicable to polysaccharide-producing bacteria
International audienceAn experimental procedure for the quantification of intracellular concentrations of metabolites in exoploysacharide-producing bacteria has been developed. This simple technique is based on the simultaneous quenching and extraction of metabolites using cold ethanol. Extracellular polysaccharide is precipitated with the cell matter generating clean samples which can be further concentrated using evaporation techniques or solid state extraction columns. Intracellular pools, coherent with the operation of the Entner–Doudoroff pathway were observed in Xanthomonas campestris
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