Fehérje-kölcsönhatások szerkezeti alapjainak feltárása és a kölcsönhatás szelektív gátlása irányított evolúciós eljárásokkal = Deciphering the structural basis of protein-protein interactions and their selective inhibition via directed evolutionary methods

Fő célom az volt, hogy meghonosítsam az irányított fehérjeevolúció szemléletét, és legsikeresebb technológiáját, a fágbemutatást. Egyrészt azt kutattuk, mi szabja meg a proteáz inhibitorok affinitását és specifitását. Három inhibitort vizsgáltunk: a kispeptid SFTI-t (Sunflower Trypsin Inhibitor), a kis fehérje SGPI-t (Schistocerca Gregaria Protease Inhibitor) és a homodimer Ecotint (E. Coli Trypsin Inhibitor). Másrészt inhibitorokat fejlesztettünk olyan humán proteázok ellen, amelyeknek nem volt ismert szelektív gátlószere. Mindhárom inhibitort sikerült evolválnunk. Feltártuk, hogy az SFTI mely csoportjai fontosak a molekula stabilitása és a proteázzal létesített specifikus kölcsönhatás szempontjából. Az SGPI családban feltártuk, hogy a hidrofób mag összetétele kihat a felszíni csoportokra és így a proteázzal alkotott komplex stabilitására. Egy rekord-felbontású SGPI variáns-tripszin komplex szerkezet által finomítottuk a szerin proteázok működési modelljét. Az Ecotint egyláncú formában fejeztük ki fágon, így a két monomer rész külön-külön evolválható lett. Szelektív inhibitorokat fejlesztettünk a hasnyálmirigy enzimek fő szabályzó proteáza, a kimotripszin C ellen, és a komplement rendszer lektin útjának MASP-1 és MASP-2 proteázai ellen. A MASP-gátlókkal létrehoztuk az első lektin út szelektív inhibitorokat, és korrigáltuk az útvonal-aktiválódás korábban hibásan leírt mechanizmusát. A projekt során 11 cikk, 3 szabadalom, 3 PhD dolgozat és tucatnyi tudományos díj született. | A major project goal was to establish in Hungary the principle and technology of directed protein evolution. Via phage display I aimed to decipher fundamental rules governing affinity and specificity of protease inhibitors focusing on 3 inhibitors: the small peptide SFTI (Sunflower Trypsin Inhibitor), the small protein SGPI (Schistocerca Gregaria Trypsin Inhibitor) and the homodimer Ecotin (E. Coli Trypsin Inhibitor). I also aimed to evolve selective inhibitors against human proteases lacking such blockers. We identified SFTI residues providing inhibitor stability and those involved in specific protease-binding. In the SGPI family we revealed that the hydrophobic inhibitor core greatly affects the function of surface residues and thereby the stability of the protease-inhibitor complex. Based on an ultrahigh resolution SGPI variant – trypsin structure we refined the model of serine protease catalysis. We displayed Ecotin on phage in a single-chain format such that the two monomers could be evolved independently. We developed selective inhibitors against a major regulatory pancreatic protease, human chymotrypsin C. We also evolved mono-specific inhibitors against the lectin pathway complement proteases MASP-1 and MASP-2. With these we developed the first lectin pathway selective complement inhibitors and corrected the hitherto incorrect pathway activation model. Altogether 11 papers, 3 patents, 3 PhD thesis and a dozen scientific awards indicate the success of the project

A humán agyi tripszin biológiai funkciójának felderítése: új stratégia = Searching for the biological function of human brain trypsin: new strategy

A primata specifikus szerin proteázt, a humán tripszin 4-et munkacsoportunk klónozta és expresszáltatta először heterológ rendszerben. Az aktív enzim kristályszerkezetét is mi határoztuk meg először. A humán tripszin 4 biológiai funkciójának felderítése volt a jelen pályázat célja. Tekintettel a fehérje primátákban való előfordulására a funkciót nem elsősorban az élettan, hanem a modern molekuláris biológia, enzimológia és sejtbiológia eszközeivel kutattuk. Végleges felderítésével ugyan adósak maradtunk, az elmúlt négy év kutatásai számos, a humán proteáz funkciójának tisztázásához támpontot nyújtó felfedezéshez vezettek. Ezek a jövetkezők: 1) Megállapítottuk, hogy a primata-specifikus tripszin 4 egyik, feltehetően biológiai szubsztrátja a mielin bázikus fehérje. 2) Post mortem emberi agy mintákból tripszinogén 4 B-izoformát izoláltunk és megállapítottuk, hogy a fehérje transzlációja egy CUG triplett által kódolt iniciátor leucinnal indul. Feltételeztük, hogy ez a mechanizmus a gén expresszió szabályozásának eszköze. 3) Felderítettük a humán tripszinogén 4 asztroglia sejten belüli transzportjának útját és aktivációjának lehetséges helyét. | For the first time human trypsin 4 was cloned and expressed in a heterologous system by our research team. The first crystal structure of this protease was also reported by our group. Exploration of the biological function of human trypsin 4 was the goal of our present grant proposal. Considering that this enzyme only occurs in Primates the biological function of trypsin 4 was studied by the means of modern molecular biology, enzymology and cell biology, rather than by those of physiology. Though we cannot unambiguosly define the biological function(s) of this protease yet, our last 4-year reserach led to several discoveries, which may provide a good basis for further exploring the physiological or pathological functions of human trypsin 4. These discoveries are as follows: 1) We provided indirect evidence that myelin basic protein (MBP) might be one of the biological substrates of human trypsin 4. 2) From samples of post mortem human brain for the first time we isolated and characterized Isoform B of trypsinogen 4 and established that the translation of human trypsinogen 4 can be initiated at a CUG codon with an N-terminal leucine residue. We proposed that this unconventional translation initiation may be a new mechanism to regulate gene expression. 3) The transport of human trypsinogen 4 was explored in astroglia cells, and the possible intracellular site of its activation was determined

Proteolízis az idegrendszerben: a humán agyi tripszin szerkezetének és funkciójának vizsgálata = Proteolysis in central nervous system: investigations of the structure and function of human brain trypsin

Klónoztunk a humán tripszinogén 4 teljes kódoló szekvenciáját. Bakterális expressziós rendszerben kifejeztük a két alternatív iniciációval keletkező izoformáját. Expresszáltuk és enzimatikusan karakterizáltuk az a tripszin 4-et. Meghatároztuk az aktív enzim benzamidin komplexének térszerkezetét. Feltérképeztük a mRNS és a fehérje eloszlását a humán agy 17 különböző régiójában. Vizsgáltuk az agyban előforduló potenciális szubsztrátjait. Megállapítottuk, hogy számos, a citoszkeletális váz felépítésében és regulálásában szereplő fehérje és a mielin bázikus fehérje szubsztrátja lehet a tripszin 4-nek. Izoláltuk a tripszinogén 4-et emberi agyszövetből és meghatároztuk amino terminális szekvenciáját. Tranziens szövettenyészetben megfelelően tervezett expressziós vektorok segítségével megállapítottuk, hogy az amino terminális leucin beépülését nem-konvencionális CTG iniciátor kodon irányítja. Meghatároztuk a tripszin - metilubellireril guanidinobenzoáttal történő reakciójának elemi sebességi állandóit. Vizsgáltuk számos természetes és szintetikus inhibitor gátló képességét, és valószínű magyarázatot adtunk arra, miért lehetetlen kanonikus mechanizmus alapján gátolni a tripszin 4-et. | We have isolated the complete coding sequence of human trypsinogen 4. In bacterial expression system we expressed and purified the two putative isoforms of the enzyme. We isolated the active enzyme as well, and characterized its enzymatic properties. We determined the X-ray structure of the trypsin 4 ? benzamidine complex. By quantitative real time PCR and sandwich ELISA we determined the determined the distribution of the mRNA and protein in 17 different regions of the human brain. By sequencing the zymogen isolated from human brain we concluded that predominant form in the human brain possesses leucine amino terminus. Using human tissue cultures transiently transfected with appropriately designed expression vectors we proved that the incorporation of the amino terminal leucine is directed by a non-conventional CTG initiation codon. We determined the elementary kinetic constants of the trypsin 4 - methylumbelliferyl guanidine benzoate reaction. We studied the inhibitory potential of several natural and synthetic polypeptides, and we reasoned why is it impossible to inhibit trypsin 4 by a canonical inhibitor

Thermodynamic analysis reveals structural rearrangement during the acylation step in human trypsin 4 on 4-methylumbelliferyl 4-guanidinobenzoate substrate analogue.

Human trypsin 4 is an unconventional serine protease that possesses an arginine at position 193 in place of the highly conserved glycine. Although this single amino acid substitution does not affect steady-state activity on small synthetic substrates, it has dramatic effects on zymogen activation, interaction with canonical inhibitors, and substrate specificity toward macromolecular substrates. To study the effect of a non-glycine residue at position 193 on the mechanism of the individual enzymatic reaction steps, we expressed wild type human trypsin 4 and its R193G mutant. 4-Methylumbelliferyl 4-guanidinobenzoate has been chosen as a substrate analogue, where deacylation is rate-limiting, and transient kinetic methods were used to monitor the reactions. This experimental system allows for the separation of the individual reaction steps during substrate hydrolysis and the determination of their rate constants dependably. We suggest a refined model for the reaction mechanism, in which acylation is preceded by the reversible formation of the first tetrahedral intermediate. Furthermore, the thermodynamics of these steps were also investigated. The formation of the first tetrahedral intermediate is highly exothermic and accompanied by a large entropy decrease for the wild type enzyme, whereas the signs of the enthalpy and entropy changes are opposite and smaller for the R193G mutant. This difference in the energetic profiles indicates much more extended structural and/or dynamic rearrangements in the equilibrium step of the first tetrahedral intermediate formation in wild type human trypsin 4 than in the R193G mutant enzyme, which may contribute to the biological function of this protease

Jelátviteli kompartmentek és proteolózis az immunválasz, valamint az immun- és idegrendszer közötti kommunikáció szabályozásában = Signaling compartments and proteolysis in regulation of immune responses and the communication between the immune- and nervous systems

Több új immunreceptor-kölcsönhatást (FcR/CR/BCR; sejthalál-R/TCR), és több szabályozó mechanizmust azonosítottunk a lipid raftok és más membrán mikro-kompartmentek, valamint limfocita adaptor fehérjék részéről, melyek fontosak a limfociták effektor funkcióiban ill. a sejthalál folyamatában. Leírtuk az utóbbi folyamatokban kritikus miozin motorfehérje izotípusok néhány molekuláris kapcsolatának szerkezeti hátterét és szabályozási lehetőségét. Kimutattuk egyes komplement (C) faktorok és receptorok sokrétű szerepét az immunválasz szabályozásában és, hogy a belőlük származtatott peptidekkel az allergiás hízósejtválasz gátolható. Leírtuk a C-rendszer szabályozó szerepét a Sclerosis Multiplex (SM) állatmodelljében is. Kimutattuk a tripszin-szerű proteáz aktivitás szabályozó szerepét a B-sejt válaszban, és valószínűsítettük szerepüket a mielin bázikus fehérje specifikus hasításában, mely fontos eleme lehet az SM kialakulásának. Eredményeink alapját képezik szelektív immunmodulánsok kifejlesztésének autoimmun ill. allergiás kórképekben. Kimutattunk egyes immunrendszeri effektor- és idegrendszeri funkciók között fellépő, a citokin hálózat ill. steroid hormonok (ösztrogének, glukortikoidok) útján megvalósuló kommunikációs útvonalakat. Új módszereket is kifejlesztettünk (pl. antigén-targetingre alkalmas egyláncú ellenanyag konstrukciók) és a projekt támogatásával beszereztünk egy konfokális mikroszkópot, melyen több új metodikát optimalizáltunk a celluláris kommunikáció vizsgálatára. | We identified several novel immunoreceptor cross-talk elements (FcR/CR/BCR; cell death-R/TCR) and regulatory mechanisms by lipid rafts, other membrane-compartments, as well as adaptor proteins, which are essential in the lymphocytes' effector functions and cell death. Structural and regulatory aspects of some important molecular interactions of myosin motor protein isotypes, essential players in the above processes, were also described. Multiple regulatory functions of the complement system in the immune response and the inhibitory potential of C3a-derived peptides in the allergic mast cell response were identified. The regulatory potential of the complement system was also shown in an animal model of Sclerosis Multiplex (SM). We have shown that trypsin-like protease activities are involved the B cell response through formation of soluble receptors and that trypsin-4, specifically cleaving MBP, may be a critical element in development of SM. Our results form a basis for development of selective immunomodulators for autoimmune- and allergic diseases. We explored several novel communication pathways between effector mechanisms of the immune system and certain nervous system functions, through the inflammatory cytokine network and steroid hormones. New methods and molecular constructs (e.g. antigen-targeting by engineered single-chain antibodies) and several modern confocal imaging techniques for studying cellular communication were also developed with the support of the grant

The Catalytic Aspartate Is Protonated in the Michaelis Complex Formed between Trypsin and an in Vitro Evolved Substrate-like Inhibitor: A REFINED MECHANISM OF SERINE PROTEASE ACTION.

The mechanism of serine proteases prominently illustrates how charged amino acid residues and proton transfer events facilitate enzyme catalysis. Here we present an ultrahigh resolution (0.93 A) x-ray structure of a complex formed between trypsin and a canonical inhibitor acting through a substrate-like mechanism. The electron density indicates the protonation state of all catalytic residues where the catalytic histidine is, as expected, in its neutral state prior to the acylation step by the catalytic serine. The carboxyl group of the catalytic aspartate displays an asymmetric electron density so that the O(delta2)-C(gamma) bond appears to be a double bond, with O(delta2) involved in a hydrogen bond to His-57 and Ser-214. Only when Asp-102 is protonated on O(delta1) atom could a density functional theory simulation reproduce the observed electron density. The presence of a putative hydrogen atom is also confirmed by a residual mF(obs) - DF(calc) density above 2.5 sigma next to O(delta1). As a possible functional role for the neutral aspartate in the active site, we propose that in the substrate-bound form, the neutral aspartate residue helps to keep the pK(a) of the histidine sufficiently low, in the active neutral form. When the histidine receives a proton during the catalytic cycle, the aspartate becomes simultaneously negatively charged, providing additional stabilization for the protonated histidine and indirectly to the tetrahedral intermediate. This novel proposal unifies the seemingly conflicting experimental observations, which were previously seen as either supporting the charge relay mechanism or the neutral pK(a) histidine theory

Circulating mitochondrial stress 70 protein/mortalin and cytosolic Hsp70 in blood: Risk indicators in colorectal cancer.

Mitochondrial mortalin and cytosolic Hsp70 are essential chaperones overexpressed in cancer cells. Our goals were to reproduce our earlier findings of elevated circulating levels of mortalin and Hsp70 in colorectal cancer (CRC) patients with a larger patient cohort, to compare death risk assessment of mortalin, Hsp70, CEA and C19-9 and to assess their prognostic value in various CRC stages. Mortalin, Hsp70, CEA and CA19-9 levels were determined in sera of 235 CRC patients enrolled in the study and followed up 5 years after surgery. Association between their concentrations and patients' survival was analyzed by Kaplan-Meier estimator and subjected to Cox Proportional hazards analysis. Serum level of mortalin was independent of that of Hsp70, CEA and CA19-9, whereas Hsp70 level weakly correlated with CEA and CA19-9 levels. Improved short-term survival was found in early or advanced disease stages associated with lower mortalin and Hsp70 levels. Cox regression analysis showed a high mortality hazard (HR = 3.7, p < 0.001) in patients with both high mortalin and Hsp70 circulating levels. Multivariate analysis showed that high mortalin and Hsp70 significantly enhances risk score over a baseline model of age, number of affected lymph nodes, CEA, CA19-9, disease stage and perioperative therapy. Analysis of mortalin and Hsp70 in CRC patients' sera adds a high prognostic value to TNM stage and to CEA and CA19-9 and identifies patients with lower or higher survival probability in all CRC stages. Determination of mortalin and Hsp70 in blood could be a useful additive prognostic tool in guiding clinical management of patients

A fehérje-fehérje kölcsönhatások szerkezeti alapjai és biológiai szerepük: multidiszciplináris megközelítés = The structural basis and biological role of protein-protein interactions: a multidisciplinary approach

Az ELTE Biokémiai Tanszék tudományos kutatásainak tengelyében évtizedek óta a fehérjék szerkezetének, funkciójának és a fehérjék közötti kölcsönhatások szerkezeti hátterének és biológiai jelentőségének felderítése áll. Valamennyi, az elmúlt négyéves pályázati ciklusban vállalt feladatunk teljesítése a fenti célokat szolgálta. A vezető kutató megítélése szerint a pályázat támogatásával elért legkiemelkedőbb eredményeink, a vállalt témák sorrendjében a következők voltak: 1) Megállapítottuk, hogy a primata-specifikus tripszin 4 egyik, feltehetően biológiai szubsztrátja a mielin bázikus fehérje és modellt dolgoztunk ki a humán tripszinogén 4 asztroglia sejteken belüli transzportjának és aktivációjának követésére 2) Hazánkban elsőként állítottuk be a fágbemutatás módszerét, melynek segítségével az eredetitől eltérő specifitású proteáz inhibitorokat állítottunk elő. 3) Megállapítottuk, hogy a miozin II motorfehérje regulációs képességének az az előfeltétele, hogy aproximális kétláncú coiled-coil szerkezet instabil legyen. 4) Felderítettük a miozin II specifikus inhibitorának, a blebbistatinnak a működésmechanizmusát. 5) Kifejlesztettünk egy új tranziens kinetikai módszert, a ?temperature-jump/stopped flow-t a módszer alkalmazásához szükséges berendezéssel együtt. | For decades the focus of scientific interest of the Biochemistry Department, Eötvös Loránd University, Budapest has been the investigation of the structural basis and biological significance of protein-protein interactions. Our research efforts during the last 4 years were to achieve specific goals along this line. In the view of the principal investigator of this grant the most outstanding scientific results achieved, or discoveries made by using the financial means of the grant are as follows: 1) We provided indirect evidence that one of the potential pathological substrate of human trypsin 4 might be myelin basic protein. Furthermore, we worked out a model to follow the transport and activation of human trypsinogen 4 within human astroglia cells. 2) For the first time in Hungary we introduced the methodology of phage-display in our department and by using this method we succeeded in producing serine protease inhibitors with altered specificity. 3) Evidence was provided that the instability of the proximal two-chain coiled structure in myosin II plays an important regulatory role in the myosin functioning 4) The mechanism of action of the inhibitor of myosin II, blebbistatin was explored. 5) We developed and set up a new method and apparatus to perform ?temperature-jump/stopped flow? transient kinetics experiments

Human serum fetuin A/α2HS-glycoprotein level is associated with long-term survival in patients with alcoholic liver cirrhosis, comparison with the Child-Pugh and MELD scores

BACKGROUND: Serum concentration of fetuin A/α2HS-glycoprotein (AHSG) is a good indicator of liver cell function and 1-month mortality in patients with alcoholic liver cirrhosis and liver cancer. We intended to determine whether decreased serum AHSG levels are associated with long-term mortality and whether the follow-up of serum AHSG levels can add to the predictive value of the Child-Pugh (CP) and MELD scores. METHODS: We determined serum AHSG concentrations in 89 patients by radial immunodiffusion. Samples were taken at the time of enrolment and in the 1(st), 3(rd), 6(th), and the 12(th )month thereafter. RESULTS: Forty-one patients died during the 1-year follow-up period, 37 of them had liver failure. Data of these patients were analysed further. Deceased patients had lower baseline AHSG levels than the 52 patients who survived (293 ± 77 vs. 490 ± 106 μg/ml, mean ± SD, p < 0.001). Of all laboratory parameters serum AHSG level, CP and MELD scores showed the greatest difference between deceased and survived patients. The cutoff AHSG level 365 μg/ml could differentiate between deceased and survived patients (AUC: 0.937 ± 0.025, p < 0.001, sensitivity: 0.865, specificity: 0.942) better than the MELD score of 20 (AUC: 0.739 ± 0.052, p < 0.001, sensitivity: 0.595, specificity: 0.729). Initial AHSG concentrations < 365 μg/ml were associated with high mortality rate (91.4%, relative risk: 9.874, 95% C.I.: 4.258–22.898, p < 0.001) compared to those with ≥ 365 μg/ml (9.3%). Fourteen out of these 37 fatalities occurred during the first month of observation. During months 1–12 low AHSG concentration proved to be a strong indicator of mortality (relative risk: 9.257, 95% C.I.: 3.945–21.724, p < 0.001). Multiple logistic regression analysis indicated that decrease of serum AHSG concentration was independent of all variables that differed between survived and deceased patients during univariate analysis. Multivariate analysis showed that correlation of low serum AHSG levels with mortality was stronger than that with CP and MELD scores. Patients with AHSG < 365 μg/ml had significantly shortened survival both in groups with MELD < 20 and MELD ≥ 20 (p < 0.0001 and p = 0.0014, respectively). CONCLUSION: Serum AHSG concentration is a reliable and sensitive indicator of 1-year mortality in patients with alcoholic liver cirrhosis that compares well to the predictive value of CP score and may further improve that of MELD score