Quantitative determination of pregnenolone 3-sulfate in rat brains using liquid chromatography/electrospray ionization-mass spectrometry

金沢大学大学院自然科学研究科分子作用学金沢大学薬学

一分子のキャラクタリゼーションを目指すLC/MS用第2世代誘導体化試薬の開発

金沢大学医薬保健研究域医学系本年度は昨年度の研究を踏まえ,誘導体化LC/MSを各種生体内ステロイドの分析に導入し,以下の成果を得た.1.アンドロステンジオール(A-diol)は主に3位硫酸抱合体として血中に存在しているが,近年,前立腺癌との関連が注目されている.硫酸抱合型A-diolには3位のほか,17位抱合体の存在も考えられるが,脱抱合を伴う従来の同定法では抱合位置が不明確であった.そこで血中から抽出した本アンドロゲンを直接,あるいは無水酢酸-ピリジンを用いてアセテートへ誘導体化後,LC/ESI-MSにより分析し,誘導体化前後でのクロマトグラフ的挙動及びマススペクトルを標品のそれと比較した.その結果,大量の3位抱合体のほか,17位抱合体も微量ながら存在することを確認した.2.遊離型A-diolのLC/ESI-MSによる高感度分析を目的としてメチルピリジニウム誘導体化し,正イオンモードでの検出を試みた.その結果,必ずしも高感度化は達せられなかったが,これは誘導体化率にも起因すると考えられることから今後に期待される.3.先に著者は,ラット脳内にカテコールエストロゲンが存在することを,無水酢酸-ピリジンによりアセテートへ誘導体化後LC/MSを用いて同定した.しかし生体内にエストロゲンがエステル体として存在することが報告されている.そこでラット脳よりエストロゲンを抽出後,重水素標識無水酢酸-ピリジンを用いて誘導体化しLC/MSで分析したところ,カテコールエストロゲンアセテートは検出されなかった.以上のようにして同定したカテコールエストロゲンが内因性のアセテートではなく,カテコール体として脳内に存在していることを確認した.研究課題/領域番号:12771377, 研究期間(年度):2000-2001出典：「一分子のキャラクタリゼーションを目指すLC/MS用第2世代誘導体化試薬の開発」研究成果報告書　課題番号 12771377（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-12771377/)を加工して作

LC/MS/MSの生体内超微量ステロイド分析への応用

金沢大学医薬保健研究域薬学系本年度は昨年度の研究を踏まえ,LC/MSにおける誘導体化の有用性をさらに明らかにすると共に,生体試料中微量ステロイド分析に応用した.1. ビタミンD骨格と選択的に反応するCookson型試薬(4-phenyl-1,2,4-triazoline-3,5-dione等)を用いてビタミンD脂肪酸エステルを誘導体化し,LC/APCI-MSに付したところ,正負両イオンモードで分子量関連イオン([M+H]^+又は[M-H]^-)のみならず特徴的なフラグメントイオンが生成し,抱合位置に関する情報も得られた.これは生体試料中ビタミンD代謝物の同定上有用な知見となり得るものであった.2. 脳内ステロイドホルモンの一種であるプレグネノロン 3-サルフェート(PS)に着目し,まず標品PSをO-methylhydroxylamine,O-pentafluorobenzylhydroxylamine又は4-(N,N-dimethylaminosulfonyl)-7-hydrazino-2,1,3-benzoxadiazole(DBD-H)で誘導体化後,負イオン検出LC-ESI-MSに付し,その諸性質を精査した.その結果,いずれも[M-H]^-が基準イオンとして観察される上に,本イオンを用いる選択イオン検出において,誘導体化前に比し約10倍の高感度な応答を示し,誘導体化の有用性が明らかとなった.また,誘導体化率,後処理の簡便性,実試料に適用した際のクロマトグラフ的挙動を考慮した結果,上記の誘導体化の中でDBD化が最も優れていた.3. 上記2の誘導体化法及び重水素化内標準物質[^2H_4]PSを用い,LC/MS(/MS)によるラット脳内PS定量法を開発し,実試料へ適用した.その結果,従来法(RIA等)による文献値(21±5 ng/g tissue)に比し,はるかに低値を示すなど,興味ある知見が得られた.研究課題/領域番号:09771943, 研究期間(年度):1997 – 1998出典：「LC/MS/MSの生体内超微量ステロイド分析への応用」研究成果報告書　課題番号09771943（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-09771943/)を加工して作

前立腺癌再燃促進物質の超高感度臨床分析法の開発

金沢大学理工研究域5α-レダクターゼは代表的なアンドロゲンであるテストステロン(T)を活性な5α-ジヒドロテストステロン(DHT)に還元する酵素であるが,前立腺癌や前立腺肥大症などのアンドロゲン依存性疾患によって,その発現量や活性が変化することが知られており,有用な5α-レダクターゼ阻害剤の開発が進められている.その評価には5α-レダクターゼ活性の測定が必須であるが,従来のそれは放射性同位体標識基質を用いる方法によるものが主で,それに伴う多くの問題を有している.そこでLC/APCI-MSによる5α-レダクターゼ活性測定法の開発を企て,以下の結果を得た.1.基質(T),生成物であるDHT及び5α-アンドロスタン-3α,17β-ジオール(3α,5α-diol)に加え,これらの5位又は3位異性体のクロマトグラフ的挙動を精査したところ,従来のカラムより高速分離可能なモノリス型カラムが有用であった.2.Tをラット前立腺より得た酵素源,NADPHと共に緩衝液中インキュベートし,反応停止後固相抽出により精製後,LC/APCI-MSに付したところ,生成物としてDHT及び3α,5α-diolに対応するピークのみ検出された.これらの前処理操作による回収率は約80%で,5-40ng/tubeでの定量が可能であった.3.本法を用いてラット前立腺中5α-レダクターゼ活性を測定したところ,K_m=0.91±0.3μM, V_=13.0±3.5nmol/min/mg protein,また代表的な5α-レダクターゼ阻害剤であるフィナステライドの阻害活性を測定したところIC_=237nMであり,いずれも報告値と符合するものであった.以上,開発した5α-レダクターゼ活性測定法は放射性同位体標識体を用いず,定量性にも優れており,5α-レダクターゼ阻害剤の開発に有用であると期待される.研究課題/領域番号:14771262, 研究期間(年度):2002 – 2004出典：「前立腺癌再燃促進物質の超高感度臨床分析法の開発」研究成果報告書　課題番号14771262（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-14771262/)を加工して作

抱合型25-ヒドロキシビタミンD分析法の開発研究

取得学位：博士(薬学)，学位授与番号：博乙第145号，学位授与年月日：平成9年9月30日,学位授与年：199

抱合型25-ヒドロキシビタミンD分析法の開発

金沢大学医薬保健研究域薬学系1.先に合成したビタミンD(D)及び25-ヒドロキシビタミンD[25(OH)D]の抱合体(サルフェート及びグルクロニド)のHPLCにおけるクロマトグラフ的挙動を精査し,D_2,D_3系相互,位置異性体相互が良好に分離する条件を設定した.2.上記の知見を基に,D,25(OH)D及び対応するプロ体のグルクロニドをβ-グルクロニダーゼ水解に付し,残存基質及び成績体をUV検出HPLCにより分析したところ,用いる酵素原により基質特異性が観察された.一方,サルフェートはほとんど酵素水解を受けなかった.3.ヒト血中25(OH)D_3のUV検出HPLCによる定量法を確立した.本法は内標準物質として非放射性物質を用いるもので,従来法に比し汎用性に優れるものであった.本法と先に開発した25(OH)D_3 3-サルフェート(3S)定量法を駆使し,健常人と慢性腎不全患者血中における25(OH)D_3と25(OH)D_33Sの相関を求めたところ,病態との関連を示唆する興味ある知見が得られた.4.D_3又は25(OH)D_3投与後の胆管ろうラット胆汁中に各々のモノグルクロニド[D_33G又は25(OH)D_3-3G,-25G]が存在することを確認した.前処理には逆相系固相抽出カートリッジと疎水性陰イオン交換ゲルを用い,グルクロニドを選択的に抽出した.同定は標品を指標とし,UV,フォトダイオードアレイUV及び誘導体化後の蛍光検出HPLCにより行った.また,2の知見を基に酵素水解し,その抱合形式とともにゲニン部の構造を確認した.特に,立体障害の大きい3級水酸基である25位への抱合が観察されたことは,興味深いものであった.研究課題/領域番号:08772060, 研究期間(年度):1996出典：研究課題「抱合型25-ヒドロキシビタミンD分析法の開発」課題番号08772060（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-08772060/）を加工して作

Degradation of Estrogen Conjugates Using Titanium Dioxide as a Photocatalyst

金沢大学大学院自然科学研究科分子作用学金沢大学薬学部日本分析化学会の許諾を得て登

Determination method for steroid 5α-reductase activity using liquid chromatography/atmospheric pressure chemical ionization-mass spectrometry

金沢大学大学院自然科学研究科分子作用学金沢大学薬学

Involvement of SIK3 in Glucose and Lipid Homeostasis in Mice

Salt-inducible kinase 3 (SIK3), an AMP-activated protein kinase-related kinase, is induced in the murine liver after the consumption of a diet rich in fat, sucrose, and cholesterol. To examine whether SIK3 can modulate glucose and lipid metabolism in the liver, we analyzed phenotypes of SIK3-deficent mice. Sik3−/− mice have a malnourished the phenotype (i.e., lipodystrophy, hypolipidemia, hypoglycemia, and hyper-insulin sensitivity) accompanied by cholestasis and cholelithiasis. The hypoglycemic and hyper-insulin-sensitive phenotypes may be due to reduced energy storage, which is represented by the low expression levels of mRNA for components of the fatty acid synthesis pathways in the liver. The biliary disorders in Sik3−/− mice are associated with the dysregulation of gene expression programs that respond to nutritional stresses and are probably regulated by nuclear receptors. Retinoic acid plays a role in cholesterol and bile acid homeostasis, wheras ALDH1a which produces retinoic acid, is expressed at low levels in Sik3−/− mice. Lipid metabolism disorders in Sik3−/− mice are ameliorated by the treatment with 9-cis-retinoic acid. In conclusion, SIK3 is a novel energy regulator that modulates cholesterol and bile acid metabolism by coupling with retinoid metabolism, and may alter the size of energy storage in mice

高脂肪食投与ラットにおけるカカオバターの摂取が脂質代謝へ及ぼす影響

現代社会における食生活の変化、特に動物性脂肪摂取量の増加は、メタボリックシンドロームをはじめとする、脂質異常症の一要因になっていると思われる。そこで本研究では、植物性脂肪である大豆油を対照として、カカオ豆の脂肪分であるが、飽和脂肪酸を多く含み常温では固体であるカカオバターと、豚の脂肪組織から精製される食用油脂ラードを用いて高脂肪食を作製し、ラットにおける高脂肪食の摂取が、脂質代謝に及ぼす影響を検討した。3週齢SD系雄性ラットを精製飼料であるAIN-93M で予備飼育後、1群6匹になるようControl群、Cacao群、Lard群の3群に分け28日間試験飼育を行った。Cacao群とLard群は20%の高脂肪食になるよう、カカオバターとラードをそれぞれの精製飼料に添加した。試験期間中26-28日目に採糞を行った。解剖後、肝臓重量、腹部大動脈血中総コレステロールおよびトリグリセリドを測定した。またFolchらの方法に従い肝臓と糞から総脂質を抽出し、肝総コレステロールおよびトリグリセリドを測定した。飼育期間全般で体重に有意差は認められなかった。しかしながら、Lard群ではControl群と比較して肝臓中の総脂質含量、総コレステロールおよびトリグリセリドが有意に増加した。同じ高脂肪食のCacao群では、これらの増加は認められなかった。糞中総脂質含量は、Cacao群が他の2群に比べ最も多かった。以上の結果より、カカオバターは高脂肪食ラットの、肝臓中総脂質含量や、総コレステロールおよびトリグリセリドの増加を、抑制する可能性が示された。Cacao群では糞中総脂質含量が増加することから、カカオバターは吸収されにくい脂質であることが示唆される