Evaluation of the food grade expression systems NICE and pSIP for the production of 2,5-diketo-D-gluconic acid reductase from Corynebacterium glutamicum

2,5-diketo-D-gluconic acid reductase (2,5-DKG reductase) catalyses the reduction of 2,5-diketo-D-gluconic acid (2,5-DKG) to 2-keto-L-gulonic acid (2-KLG), a direct precursor (lactone) of L-ascorbic acid (vitamin C). This reaction is an essential step in the biocatalytic production of the food supplement vitamin C from D-glucose or D-gluconic acid. As 2,5-DKG reductase is usually produced recombinantly, it is of interest to establish an efficient process for 2,5-DKG reductase production that also satisfies food safety requirements. In the present study, three recently described food grade variants of the Lactobacillales based expression systems pSIP (Lactobacillus plantarum) and NICE (Lactococcus lactis) were evaluated with regard to their effictiveness to produce 2,5-DKG reductase from Corynebacterium glutamicum. Our results indicate that both systems are suitable for 2,5-DKG reductase expression. Maximum production yields were obtained with Lb. plantarum/pSIP609 by pH control at 6.5. With 262 U per litre of broth, this represents the highest heterologous expression level so far reported for 2,5-DKG reductase from C. glutamicum. Accordingly, Lb. plantarum/pSIP609 might be an interesting alternative to Escherichia coli expression systems for industrial 2,5-DKG reductase production

Heterologous expression of Oenococcus oeni malolactic enzyme in Lactobacillus plantarum for improved malolactic fermentation

Lactobacillus plantarum is involved in a multitude of food related industrial fermentation processes including the malolactic fermentation (MLF) of wine. This work is the first report on a recombinant L. plantarum strain successfully conducting MLF. The malolactic enzyme (MLE) from Oenococcus oeni was cloned into the lactobacillal expression vector pSIP409 which is based on the sakacin P operon of Lactobacillus sakei and expressed in the host strain L. plantarum WCFS1. Both recombinant and wild-type L. plantarum strains were tested for MLF using a buffered malic acid solution in absence of glucose. Under the conditions with L-malic acid as the only energy source and in presence of Mn2+ and NAD+, the recombinant L. plantarum and the wild-type strain converted 85% (2.5 g/l) and 51% (1.5 g/l), respectively, of L-malic acid in 3.5 days. Furthermore, the recombinant L. plantarum cells converted in a modified wine 15% (0.4 g/l) of initial L-malic acid concentration in 2 days. In conclusion, recombinant L. plantarum cells expressing MLE accelerate the malolactic fermentation

ANWENDUNG VON MEMBRANVERFAHREN BEI DER SIMULTANEN HERSTELLUNG VON MANNITOL UND GLUCONSÄURE AUS SACCHAROSE DURCH KONJUGIERTE NAD *-ABHÄNGIGE DEHYDROGENASEN

Es wird ein Verfahren zur simultanen und kontinuierlichen Herstellung von Gluconsäure und Mannitol durch konjugierte NAD(H)-abhängige Dehydrogenasen innerhalb eines Membranreaktors beschrieben. Die Synthese löslicher polymergebundener von Glucose- und Mannitol-Dehydrogenase akzeptierter Coenzyme, sowie die Herstellung von Hohlfasermembranen, die zu ihrer Rückhaltung innerhalb des Reaktors geeignet sind, werden dargestellt. Erstmals wird eine Mannitol-Dehydrogenase mit NAD(H) -Spezifität beschrieben. Die Einsatzmöglichkeiten der Elektrodialyse zur Aufrechterhaltung des optimalen pH und als Stufe der Produktaufarbeitung werden diskutiert. Experimentelle Daten zur Reaktorperformance werden mit Modellrechnungen verglichen. Die in der Nahrungsmittelindustrie zum Einsatz kommenden enzymtechnologischen Verfahren beschränken sich bisher fast ausschließlich auf coenzymunabhängige Reaktionen (Hydrolysen, Isomerisierungen). Erst in den letzten Jahren wird versucht, insbesondere NAD (P)*-abhängige Enzyme für die Synthese von wirtschaftlich interessanten Produkten wie z.B. L-Aminosäuren oder Derivaten von Monosacchariden zu nutzen. Um mit derartigen Enzym-Coenzym-Systemen im größeren Maßstab ökonomisch arbeiten zu können, ist es erforderlich, die Coenzyme - wie auch die Enzyme - in nur katalytischen Konzentrationen einzusetzen und sie durch kontinuierliche Regeneration für eine möglichst große Zahl von Reaktionszyklen wiederverwendbar zu machen. Prinzipiell kommen enzymatische und nicht-enzymatische (chemische, elektrochemische) Verfahren fiir die Coenzymregeneration in Betracht. In der Praxis haben sich die enzymatischen Cofaktor-Regenerationssysteme am besten bewährt. Bei der Entwicklung enzymatischer Syntheseverfahren für L-Aminosäuren mittels reduktiver Transaminierung entsprechender durch chemische Synthese leicht zugänglicher Ketocarbonsäuren konnten Wandrey und Mitarbeiter /1-3/ erstmals das Prinzip der Cofaktorregeneration für einen Redoxprozeß in einem über die Laboranlage hinausgehenden Maßstab realisieren. Jedoch muß man bei diesen Prozessen in Kauf nehmen, daß die das Coenzym regenerierende Hilfsreaktion ein nicht verwendbares Produkt liefert (Abb. 1, Beispiel 1