Investigation of hypoxia as a contributing factor to cancer cell survival under tumor microenviroment stress: the role of NPM1 protein

It is well-established that hypoxia is a distinguished feature of solid tumors. Hypoxia-Inducible Factors (HIFs) are a family of transcription factors that mediate the cellular response to hypoxic stress. HIF-1, the most studied member of HIFs, forms a functional heterodimer consisting of an oxygen-labile HIF-1α subunit and a HIF-1β subunit also known as ARNT (Aryl Hydrocarbon Nuclear Translocator), which exhibits stable expression. Despite the well-described oxygen-dependent regulation of HIF-1α, there is evidence of its oxygen-independent control by various post-translational modifications. The present dissertation aims to further elucidate the regulation of HIF-1α by ERK1/2 kinases. Previously published research established that ERK1/2 phosphorylate HIF-1α at serines 641/643, in an area designated as ETD (ERK Targeted Domain), thus masking an adjacent nuclear export signal, and promoting the accumulation of HIF-1α in the nucleus and the transcriptional activity of HIF-1 (Mylonis, 2008, JBC). Preliminary results from the Doctoral Candidate’s Master thesis indicated that ERK-mediated phosphorylation regulates the interaction between HIF-1α and the multifunctional protein NPM1 (nucleophosmin).During this thesis it was shown that HIF-1α and NPM1 associate within cancer cells when ERK1/2 are active or when the ETD carries the phosphomimetic SE mutation (serine 641 to glutamate). Furthermore, experiments showed that this interaction is both direct and specific for HIF-1α, as no association between NPM1 and HIF-2α was observed, while it was demonstrated that NPM1 favors interaction with HIF-1α that is part of the HIF-1α/ARNT heterodimer.Moreover, chromatin immunoprecipitation experiments revealed that NPM1 is required for phosphorylation-dependent recruitment of HIF-1 to hypoxia response DNA elements. In concert, silencing of NPM1 expression diminished HIF-1 mediated transcription of hypoxia target genes and the activation of HIF-1 dependent synthetic promoter, while it also had a negative impact on HIF-1α association with elements of open chromatin. Transcriptome analysis revealed a significant number of hypoxia-related genes commonly regulated by NPM1 and HIF-1. Data mining at publicly available cancer patient databases revealed that this set of genes is enriched in cancer types along with NPM1 and HIF-1α, and their expression exhibited significant negative correlation with patients’ survival. Supporting these data, silencing of NPM1 expression under hypoxia inhibited HIF-1 mediated metabolic adaptation of cancer cells and triggered apoptosis and cell death. The described mechanism of ERK-mediated optimal activation of HIF-1α its interaction with NPM1, which is essential for cancer cell survival under low oxygen, could provide a promising target for anticancer drug development.Η υποξία είναι μία χαρακτηριστική ιδιότητα των συμπαγών όγκων. Η απόκριση των καρκινικών κυττάρων στην μειωμένη διαθεσιμότητα οξυγόνου πραγματοποιείται κατά κύριο λόγο από τα μέλη της οικογένειας μεταγραφικών ενεργοποιητών που είναι γνωστοί ως μεταγραφικοί παράγοντες που επάγονται από την υποξία (Hypoxia Inducible Factors, HIFs). Οι HIFs δεσμεύονται σε περιοχές υποκινητών γονιδίων, πάνω σε στοιχεία γνωστά ως HREs (Hypoxia Response Elements) και ενεργοποιούν την μεταγραφή γονιδίων τα οποία συνεισφέρουν στην απόκριση των κυττάρων στην υποξία. Ο HIF-1, το ευρύτερα μελετημένο μέλος της οικογένειας, είναι ετεροδιμερές της υπομονάδας HIF-1α που υπόκειται σε ρύθμιση από το οξυγόνο με αποτέλεσμα να αποικοδομείται σε φυσιολογικές συνθήκες (νορμοξία) και της υπομονάδας HIF-1β, γνωστής και ως ARNT (Aryl Hydrocarbon Nuclear Translocator), η οποία παρουσιάζει συνεχή έκφραση. Εκτός από την οξυγονοεξαρτώμενη ρύθμιση, έχει δειχθεί ότι η α υπομονάδα ρυθμίζεται και ανεξάρτητα από το οξυγόνο μέσω μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων. Η παρούσα διατριβή εμβαθύνει στην ρύθμιση του HIF-1α από τις κινάσες ERK1/2. Σε προηγούμενες δημοσιευμένες μελέτες του εργαστηρίου αποδείχθηκε πειραματικά ότι οι ERK1/2 φωσφορυλιώνουν τον HIF-1α στις σερίνες Ser 641/643 εντός μιας επικράτειας που ονομάστηκε ETD (ERK Targeted Domain) με αποτέλεσμα να αποκρύπτουν ένα παρακείμενο σήμα πυρηνικής εξαγωγής και να προωθούν την συσσώρευση του HIF-1α στον πυρήνα και την μεταγραφική ενεργότητα του HIF-1. Προκαταρτικά πειράματα, στα πλαίσια της μεταπτυχιακής εργασίας του ΥΔ, έδειξαν ότι η φωσφορυλίωση του HIF-1α από τις ERK1/2 ρυθμίζει την αλληλεπίδραση του HIF-1α με την πολυλειτουργική πρωτεΐνη NPM1 (νουκλεοφοσμίνη).Στην παρούσα διατριβή δείχθηκε ότι οι HIF-1α και NPM1 αλληλεπιδρούν εντός των κυττάρων όταν οι ERK1/2 είναι ενεργές ή όταν η ETD φέρει την φωσφομιμητική μετάλλαξη SE (σερίνη 641 σε γλουταμινικό οξύ). Αποδείχθηκε πειραματικά ότι η σύνδεση των δυο πρωτεϊνών είναι άμεση και ειδική για τον HIF-1α, χωρίς να παρατηρείται αντίστοιχη αλληλεπίδραση της NPM1 με τον HIF-2α, ενώ επιπρόσθετα αποκαλύφθηκε ότι η NPM1 δεσμεύεται ισχυρότερα με τον HIF-1α όταν είναι μέρος του ετεροδιμερούς HIF-1α/ARNT. Επιπλέον, πειράματα ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης έδειξαν ότι η παρουσία της NPM1 σε περιοχές της χρωματίνης που γειτνιάζουν με λειτουργικά HREs είναι αναγκαία για την εξαρτώμενη από την φωσφορυλίωση σύνδεση του HIF-1 σε αυτά τα στοιχεία. Ακολούθως δείχθηκε ότι αυτός ο μηχανισμός έχει σημαντική επίδραση στην ενεργότητα του HIF-1. Αποσιώπηση της έκφρασης της NPM1 στην υποξία είχε ως αποτέλεσμα την μείωση της ενεργοποίησης ενός τεχνητού υποκινητή που εξαρτάται από τον HIF-1, την μείωση της μεταγραφής γνωστών γονιδίων στόχων του HIF-1 και την μείωση της σύνδεσης του HIF-1 με στοιχεία της ενεργής χρωματίνης. Επιπρόσθετα σε αποτελέσματα αλληλούχισης RNA η αποσιώπηση σε συνθήκες υποξίας είτε της έκφρασης της NPM1 είτε εκείνης του HIF-1α είχε παρόμοιο αποτέλεσμα στην μεταγραφή σημαντικού αριθμού γονιδίων που ρυθμίζονται από την υποξία. Για το σύνολο των γονιδίων των οποίων η επαγωγή στην υποξία βασίζεται στην παρουσία και των 2 πρωτεϊνών δείχθηκε ότι σε ορισμένους καρκινικούς τύπους η έκφραση τους συσχετίζεται αφενός θετικά με την έκφραση των γονιδίων NPM1, HIF1A και γονιδίων που χαρακτηρίζουν την υποξία και αφετέρου αρνητικά με την επιβίωση των ασθενών. Σε συμφωνία με αυτά τα αποτελέσματα αποδείχθηκε πειραματικά ότι σε συνθήκες υποξίας η αποσιώπηση της έκφρασης της NPM1 είχε ως αποτέλεσμα αφενός την μείωση του διαμεσολαβούμενου από τον HIF-1 επαναπρογραμματισμού του μεταβολισμού των καρκινικών κυττάρων και αφετέρου την αύξηση του κυτταρικού θανάτου λόγω απόπτωσης. Τα αποτελέσματα της διατριβής αποκαλύπτουν ένα νέο μηχανισμό ρύθμισης της δράσης του HIF-1, η στόχευση του οποίου από την αντικαρκινική θεραπεία μπορεί να δώσει αξιόλογα αποτελέσματα στην αντιμετώπιση των συμπαγών όγκων

Adhesion formation and intraperitoneal catheters: experimental study

Background. Adhesion formation caused by the use of foreign materials is a major medical and financial problem. The aim of this study is to compare the histological findings in intraperitoneal adhesion development due to long standing tubes, used in common surgical practice, in a rat model. Methods. Pieces of Polyurethane, Teflon, Silicone and Polyvinyl Chloride (PVC) from commercial available intravenous catheters (7F) were placed intraperitoneally in thirty-six female Wistar rats randomly assigned to four groups. Three months later, histologic evaluation by two independent pathologists was done blindly. The number of organs involved was examined, and the degree of inflammatory infiltration, thickness, extent and density of the adhesions were graded in a score system. Results. The overall adhesion score differed significantly (p<0.01) among the groups, the highest being in the Teflon group (mean: 13.2), followed by the PVC group (10), the silicone group (9.6) and the polyurethane group which was the lowest (6.8). Discussion. Polyurethane caused the least adhesion development in this experimental model than the other materials and therefore can be used more extensively for the construction of catheters for intraperitoneal use. This is clinically important in cases where indwelling intra-peritoneal catheters for prolonged use are necessary.Σκοπός της μελέτης είναι η σύγκριση της δημιουργίας συμφύσεων, σε ένα πειραματικό μοντέλο, μετά από την ενδοπεριτοναϊκή τοποθέτηση τεσσάρων υλικών, τα οποία χρησιμοποιούνται για τη κατασκευή ενδοπεριτοναϊκών καθετήρων. Τμήματα πολυουρεθανίου, τεφλόν, σιλικόνης και πολυβινυλοχλωριδίου (PVC) τοποθετήθηκαν ενδοπεριτοναϊκά σε 36 θηλυκούς αρουραίους τύπου Wistar. Η ανάπτυξη συμφύσεων εκτιμήθηκε ποσοτικά με τη κλίμακα Nair. To πολυουρεθάνιο προκάλεσε το μικρότερο σχηματισμό συμφύσεων ενώ υψηλότερη βαθμολογία στη κλίμακα Nair έλαβαν τα πειραματόζωα της ομάδας πολυβινυλοχλωριδίου PVC. Όταν συγκρίναμε το πάχος και τη σταθερότητα των συμφύσεων ανάμεσα στις τέσσερις ομάδες, παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές, με την ομάδα του πολυουρεθανίου να παρουσιάζει λεπτές και χαλαρές συμφύσεις. Αντίθετα, σχεδόν όλα τα πειραματόζωα της ομάδας τεφλόν ανέπτυξαν παχιές και πυκνές συμφύσεις. Συμπερασματικά, το πολυουρεθάνιο προκάλεσε τη μικρότερη δημιουργία συμφύσεων σε σχέση με τα υπόλοιπα υλικά και μπορεί να χρησιμοποιηθεί ευρύτερα για τη κατασκευή ενδοπεριτοναϊκών καθετήρων παρατεταμένης χρήσης

Hepcidin as a Sensitive and Treatment-Responsive Acute-Phase Marker in Patients with Bacteremia: A Pilot Study

Hepcidin regulates iron metabolism by inhibiting intestinal iron absorption and iron release from iron stores. In addition to iron overload, inflammatory conditions also up-regulate hepcidin synthesis, which may serve as an antimicrobial defense by reducing iron availability to the invading microbes. The purpose of this study is to test this hypothesis in human patients by determining serum hepcidin concentration by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) in healthy blood donors (n = 60) and patients hospitalized because of bacteremia (n = 50), before (day 0) and after seven days (day 7) of appropriate antibiotic treatment. Serum hepcidin was significantly increased in patients with bacteremia, both at day 0 and at day 7, compared to healthy controls. However, there was significant reduction of serum hepcidin after 7-day treatment, in concert with changes in serum C-reactive protein (CRP). The hepcidin changes were similar for both Gram-negative and Gram-positive single infection cases, while CRP was significantly reduced only in the former. In contrast to hepcidin, the levels of serum ferritin in the patients remained high after treatment, irrespective of infection type. These data confirm the stimulation of hepcidin secretion in human subjects upon different types of systemic microbial infection and suggest that hepcidin is a more sensitive and treatment-responsive acute-phase marker than ferritin in bacteremia, which needs to be explored with bigger-sized and better-matched patient cohorts