Synthesis of bioactive compounds using singlet oxygen

In the current Thesis, the application of [4+2] cycloaddition reaction of singlet oxygen with furans is presented, as a crucial step, not only in the development of new methodologies, but also in the synthesis of natural products. The results can be summarized as follows:The design and synthesis of novel non-peptidic molecules, potent AVPI tetrapeptide-mimics, found in Smac/Diablo protein, are reported. This protein has the ability to provoke apoptosis (normal programmed cell death) in human cells, through binding of its N-terminus tetrapeptide (AVPI) to the human X-linked inhibitors of apoptosis proteins (XIAPs). The motif of Meyers bicyclic lactams could potentially act as an AVPI mimic, employing as a key step in its synthesis, the photooxidation reaction of simple furan substrates. The applied synthetic method offers the possibility of developing a small library of compounds for biological evaluation.A new, exceptionally efficient methodology for the regioselective and quantitative synthesis of γ-hydroxybutenolides was developed, through photooxygenation of 2-thiophenyl-substituted furans. The thiophenyl moiety directs the formation of γ-hydroxybutenolides. This conversion is proposed to occur through radical scission of the endoperoxide formed through [4+2] cycloaddition of 2-thiophenyl furans with 1Ο2.The total synthesis of the natural product (+)-yaoshanenolide B is presented for the first time in literature, employing as a key step an endo and highly selective Diels-Alder reaction, based on a biosynthetic scenario. Through completion of this synthetic route, we revised the proposed structure of yaoshanenolide B to one of its diastereomers instead.Στην παρούσα ερευνητική εργασία παρουσιάζεται η αξιοποίηση της αντίδρασης [4+2] κυκλοπροσθήκης του διεγερμένου οξυγόνου με φουρανικά υποστρώματα στην ανάπτυξη νέων μεθοδολογιών, καθώς και η εφαρμογή τους στη σύνθεση φυσικών προϊόντων. Τα αποτελέσματα συνοψίζονται ως εξής:Παρουσιάζεται η μεθοδολογία σύνθεσης μιας νέας κατηγορίας μη πεπτιδικών ενώσεων, πιθανών μιμητών του τετραπεπτιδίου AVPI της πρωτεΐνης Smac/Diablo. Η πρωτεΐνη αυτή έχει την ικανότητα να επάγει την απόπτωση των κυττάρων στον ανθρώπινο οργανισμό, μέσω πρόσδεσης αυτού του Ν-τελικού τετραπεπτιδίου της στους ανθρώπινους Χ-linked αναστολείς των πρωτεϊνών απόπτωσης (XIAPs). Ως μιμητής αυτού του τετραπεπτιδίου θα μπορούσε να λειτουργήσει το δομικό μοτίβο των δικυκλικών λακταμών του Meyers, η σύνθεση των οποίων περιλαμβάνει ως στάδιο-κλειδί τη φωτοξείδωση ενός απλού φουρανικού υποστρώματος. Η συνθετική πορεία που εφαρμόστηκε προσφέρεται για το σχηματισμό μιας μικρής βιβλιοθήκης μορίων για βιολογική αποτίμηση.Αναπτύχθηκε μια νέα, εξαιρετικά αποτελεσματική μεθοδολογία για τον τοποεκλεκτικό και ποσοτικό σχηματισμό γ-υδροξυβουτενολιδίων μέσω φωτοξείδωσης 2-θειοφαινυλο-υποκατεστημένων φουρανίων. Η θειοφαίνυλο ομάδα προσανατολίζει το σχηματισμό των γ-υδροξυβουτενολιδίων. Προτείνεται ότι η μετατροπή αυτή λαμβάνει χώρα μέσω ομολυτικής διάσπασης του ενδοϋπεροξειδίου που προκύπτει από την [4+2] κυκλοπροσθήκη του 1Ο2 στο φουρανικό δακτύλιο.Παρουσιάστηκε για πρώτη φορά στη βιβλιογραφία η ολική σύνθεση του φυσικού προϊόντος (+)-yaoshanenolide B, που έχει ως στάδιο «κλειδί» μια ενδο-εκλεκτική αντίδραση κυκλοπροσθήκης [4+2] Diels-Alder στη βάση ενός βιομιμητικού σεναρίου. Μέσω ολοκλήρωσης της συνθετικής μας πορείας, διαπιστώθηκε ότι η πραγματική δομή του (+)-yaoshanenolide Β δεν είναι η προταθείσα από την ερευνητική ομάδα που την απομόνωσε, αλλά ένα διαστερεομερές της

Dehydrogenative cycloaddition of tethered 1, n-dihydrodisilanes to alkynes catalyzed by gold nanoparticles

Στην παρούσα ερευνητική εργασία παρουσιάζεται η γενίκευση της μεθοδολογίας της οξειδωτικής κυκλοπροσθήκης του 1,1,3,3-τετραμεθυλοδισιλοξανίου σε αλκύνια και σε άλλα 1,n-διυδρο ολιγοσιλάνια, όπως επίσης και η μηχανιστική μελέτη των αντιδράσεων αυτών. Επιπλέον, παρουσιάζεται η συνθετική αξιοποίηση των προϊόντων αυτών των αντιδράσεων, δηλαδή των 2,5-διυδρο-1,2,5-οξαδισιλολίων σε αντιδράσεις σύζευξης C-C παρουσία Pd(II) και αρυλο ιωδιδίων, τη γνωστή σύζευξη τύπου Hiyama. Τα αποτελέσματα συνοψίζονται ως εξής: · Ο Au/TiO2 καταλύει την οξειδωτική κυκλοπροσθήκη των 1,1,3,3- τετραφαινυλοδισιλοξάνιο (2), 1,1,1,3,5,7,7,7 οκταμεθυλοτετρασιλοξάνιο (3), 1,1,3,3,5,5 εξαμεθυλοτρισιλοξάνιο (4) και το 1,2- δις(διμεθυλο)σιλυλοβενζόλιο (5) σε αλκύνια σε υψηλές αποδόσεις, ωστόσο οι αντιδράσεις αυτές ειναι σχετικά πιο αργές συγκριτικά με το 1,1,3,3- τετραμεθυλοδισιλοξάνιο, ενώ απαιτείται περισσότερη ποσότητα καταλύτη. · Αναφέρεται για πρώτη φορά στη βιβλιογράφια ο σχηματισμός του επταμελούς ετεροκυκλικού δακτυλίου των 4,7-διυδρο-1,3,2,4,7-διοξοτρισιλεπινών. · Προτείνεται ένας εύλογος μηχανισμός στην αντίδραση οξειδωτικής κυκλοπροσθήκης 1,n-διυδρο ολιγοσιλανίων σε αλκύνια, που περιλαμβάνει την τυπική [3+2] κυκλοπροσθήκη ενός κυκλικού δισιλυλο ενδιαμέσου του Au με το π σύστημα του αλκυνίου. · Παρατηρήθηκε η μόνο-ή δι υποκατάσταση αρυλομάδων στην καταλυόμενη από Pd(II) σύζευξη τύπου Hiyama των 2,5-διυδρο-1,2,5-οξαδισιλολίων, η οποία πιθανότατα σχετίζεται με την στερεοχημική παρεμπόδιση στον τεταρτοταγή ολεφινικό άνθρακα του αντιδρώντος.In the current Thesis a generalized methodology of the dehydrogenative addition of 1,n-dihydro-tethered oligosilanes to alkynes is presented. Furthermore, mechanistic studies regarding the reaction among 1,1,3,3 tetramethyldisiloxane and alkynes were carried out. In addition, we present the synthetic use of 2,5-dihydro-1,2,5-oxadisiloles, products of these reactions, in C-C coupling reactions with aryl iodides catalyzed by Pd(II), the known Hiyama coupling. The results can be summarized as follows: · Au/TiO2 catalyzes the dehydrogenative addition of 1,1,3,3- tetraphenyldisiloxane, 1,1,1,3,5,7,7,7-octamethyltetrasiloxane, 1,1,3,3,5,5- hexamethyltrisiloxane and 1,2-bis(dimethylsilyl)benzene to alkynes in high yields. · The formation of the seven-membered heterocyclic ring of 4,7-dihydro- 1,3,2,4,7 dioxatrisilepines by the Au-catalyzed reaction among alkynes and 1,1,3,3,5,5-hexamethyltrisiloxane appears for first time in literature. · The mechanism of the dehydrogenative addition of 1,1,3,3- tetramethyldisiloxane to alkynes is postulated, which includes a formal [3+2] cycloaddition via a cyclo-gold-disiloxane intermediate. · The Hiyama coupling (Pd(II), aryl iodides) of 2,5-dihydro-1,2,5-oxadisiloles was studied and found to form products of mono or di-substitution depending on the steric hindrance of the tertiary olefinic carbon atom of the reacting oxadisilole

Structural and physicochemical characterization of the type III secretion system protein HrpA of Pseudomonas syringae pv. phaseolicola

Το εκκριτικό σύστημα τύπου ΙΙΙ (Τ3SS, Type three secretion system), είναι ένας εξειδικευμένος μοριακός μηχανισμός, ο οποίος καθιστά ικανά πολλά Gram-αρνητικά βακτήρια να εκκρίνουν και να διοχετεύουν τοξικές πρωτεΐνες στο κυτταρόπλασμα του ευκαρυωτικού ξενιστή τους. Στα φυτοπαθογόνα βακτήρια το μονοπάτι έκκρισης κωδικοποιείται από τα γονίδια hrp (HR και pathogenicity) και hrc (HR και conserved). H παρούσα εργασία ασχολείται με τη δομική μελέτη τη πρωτεΐνης HrpA, η οποία είναι μια μικρή υδροφιλική πρωτεΐνη του Τ3SS της P. syringae pv. phaseolicola. H HrpA είναι η κύρια δομική πρωτεΐνη του αγωγού (pilus) του Τ3SS, του οποίου η δομή μοιάζει με τις γνωστές βελονοειδείς δομές (needle) των ζωοπαθογόνων βακτηρίων, ενώ η διάμετρος του υπολογίζεται περίπου στα 6 έως 8 nm και το μήκος μέχρι 2 μm. Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη ΗrpA αγρίου τύπου, υπερεκφράστηκε και απομονώθηκε με χρωματογραφία συγγένειας. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε φυσικοχημική και δομική μελέτη της πρωτεΐνης, μεταβάλλοντας διάφορες παραμέτρους (pH, συγκέντρωση, χρόνο ανάπτυξης, θερμοκρασία) με μεθόδους κυκλικού διχρωισμού (CD), φασματοσκοπίας υπερύθρου με μετασχηματισμό Fourier (FTIR), φασματοσκοπίας Raman (Raman spectroscopy), και ηλεκτρονικής μικροσκοπίας διέλευσης υψηλής ανάλυσης (high resolution TEM). Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε δομικός και φυσικοχημικός χαρακτηρισμός του μεταλλάγματος HrpAΔC8 σε διάφορες συνθήκες με χρωματογραφία μοριακής διήθησης, CD, σκέδαση ακτίνων Χ σε μικρές γωνίες (SAXS) και high resolution TEM Τέλος, ακολουθήθηκε πρωτόκολλο απομόνωσης του αγωγού του T3SS (pilus) από την P. syringae pv. phaseolicola, με σκοπό να μελετηθούν οι δομικές του ιδιότητες με ηλεκτρονική μικροσκοπία διέλευσης υψηλής ανάλυσης (HRTEM) και να συγκριθούν με τις πολυμερικές ιδιότητες που έχει η ανασυνδυασμένη HrpA να σχηματίζει ινώδεις δομές με χαρακτηριστικές διαστάσεις που κυμαίνονται από την μάκρο- στην μίκρο- κλίμακα. Σύμφωνα με τις παρατηρήσεις από το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο υψηλής διακριτικής ικανότητας, η πρωτεΐνη αυτό-οργανώνεται in vitro, σχηματίζοντας ινίδια με διαστάσεις που μοιάζουν σημαντικά με τα δομικά χαρακτηριστικά του αγωγού του T3SS της P. syringae pv. phaseolicola. Συμπερασματικά, ενώ η HrpA προβλέπεται σαν α-ελικοειδής πρωτεΐνη, το φάσμα κυκλικού διχρωισμού της, παρουσιάζει χαμηλά ποσοστά α-έλικας ενώ μοιάζει πολύ με το φάσμα των αποδιπλωμένων πρωτεϊνών. Τα πειράματα φασματοσκοπίας RAMAN, FTIR και SAXS που πραγματοποιήθηκαν, επιβεβαιώνουν τις παρατηρήσεις από το CD.Type III secretion systems (T3SSs) are needle-like structures used by Gram negative bacteria to translocate bacterial proteins (effectors) into eukaryotic cells. The T3SS pathway of plant pathogens is encoded by hrp (HR and pathogenicity) and hrc (HR and conserved) genes. The structural study of the HrpA protein, a small hydrophilic protein of the T3SS of P. syringae pv. phaseolicola will be presented. HrpA is the major component of T3SS pilus, a needle-like structure, whose diameter is about 6-8 nm and its length up to 2 μm. Recombinant wild type HrpA was overexpressed and purified by affinity chromatography. Moreover, physicochemical and structural study of HrpA protein was performed under different parameters (pH, concentration, shelf-life and temperature) with CD, FTIR, Raman spectroscopy and high resolution TEM. In addition, physicochemical and structural characterization of deletion mutant (HrpAΔC8) also took place under various conditions with affinity chromatography, CD, SAXS and high resolution TEM. Finally, the pilus of P. syringae pv. phaseolicola was purified in order to study its structural properties with HRTEM and to compare them with those of polymerized recombinant HrpA which forms fibre-like structures with nano- to micron scale features. According to the HRTEM observations, the in vitro formed fibers strongly resemble the structural parameters of Τ3SS pilus. Whereas HrpA is predicted to be a highly α-helical protein, its CD spectra indicate very low α-helical content and strongly resemble those of disordered proteins. Raman spectroscopy, FTIR and SAXS also support the CD observations