ЗАСТОСУВАННЯ КАЛЬЦІЮ ІОНОФОРУ У ПАЦІЄНТОК ЗІ ЗНИЖЕНИМ РЕПРОДУКТИВНИМ ПРОГНОЗОМ У ПРОТОКОЛАХ ДРТ

The aim of the study – to learn the effectiveness of the use of Ca ionophore in IVF – ICSI protocols in patients with a reduced reproductive prognosis. Materials and Methods. A study was conducted of the effectiveness of the method of oocyte activation in ECO-ICSI protocols in patients after at least one unsuccessful attempt of ART. Identical CSR protocols were used. Effectiveness was estimated on the basis of embryological (frequency of fertilization, embryo cleavage, percentage of blastulation) and clinical indicators (frequency of pregnancy). Results and Discussion. The use of calcium ionophore at the time of the ICSI procedure allows to improve the percentage of oocyte fertilization, the percentage of cleavage, the percentage of blastulation. This, in turn, has increased the pregnancy rate in the IVF-ICSI treatment. Conclusion. Improvement of embryological parameters allowed to significantly improve the results of the frequency of pregnancy in women of older reproductive age with a reduced prognosis for the occurrence of pregnancy.Мета дослідження – вивчення ефективності використання Са іонофору в протоколах ЕКЗ – ICSI у пацієнток зі зниженим репродуктивним прогнозом. Матеріали та методи. Проведено дослідження ефективності методики активації ооцитів у протоколах ЕКЗ – ICSI у пацієнток після як мінімум однієї невдалої спроби ДРТ. Застосовували ідентичні протоколи КСО. Результативність оцінювали, виходячи з ембріологічних (частота запліднення, дроблення ембріонів, відсоток бластуляції) і клінічних показників (частота настання вагітності). Результати дослідження та їх обговорення. Застосування кальцію іонофору в момент проведення процедури ICSI дозволяє поліпшити відсоток запліднення ооцитів, відсоток дроблення, відсоток бластуляції. Це, у свою чергу, дозволило підвищити частоту настання вагітності в програмах ЕКЗ – ICSI. Висновок. Поліпшення ембріологічних показників дозволило істотно поліпшити результати щодо частоти настання вагітності в жінок старшого репродуктивного віку зі зниженим прогнозом по настанню вагітності.Мета дослідження – вивчення ефективності використання Са іонофору в протоколах ЕКЗ – ICSI у пацієнток зі зниженим репродуктивним прогнозом. Матеріали та методи. Проведено дослідження ефективності методики активації ооцитів у протоколах ЕКЗ – ICSI у пацієнток після як мінімум однієї невдалої спроби ДРТ. Застосовували ідентичні протоколи КСО. Результативність оцінювали, виходячи з ембріологічних (частота запліднення, дроблення ембріонів, відсоток бластуляції) і клінічних показників (частота настання вагітності). Результати дослідження та їх обговорення. Застосування кальцію іонофору в момент проведення процедури ICSI дозволяє поліпшити відсоток запліднення ооцитів, відсоток дроблення, відсоток бластуляції. Це, у свою чергу, дозволило підвищити частоту настання вагітності в програмах ЕКЗ – ICSI. Висновок. Поліпшення ембріологічних показників дозволило істотно поліпшити результати щодо частоти настання вагітності в жінок старшого репродуктивного віку зі зниженим прогнозом по настанню вагітності

Enhancement of internalization of diphtheria toxin recombinant fragments in sensitive cells mediated by toxin’s T-domain

Subunit B of diphtheria toxin (DT) and its R-domain differ by the presence of T-domain. The aim of the present work was to analyze the interaction of these toxin fragments with mammalian cells in order to evaluate the T-domain’s influence on endocytosis in resistant cells. Internalization of recombinant fluorescent subunit B and R-domain was characterized in toxin-resistant L929 cells derived from mouse connective tissue and toxin-sensitive Vero cells from African green monkey kidney. It was found that during incubation of cells in the presence of both subunit B and R-domain in the culture medium, Vero cells internalize more molecules of subunit B than of R-domain. Under the same conditions, L929 cells internalize more molecules of R-domain than of subunit B. Colocalization of fluorescent subunit B and R-domain in L929 was rapid and proceeded almost completely at the early period of incubation compared to Vero cells in which it was slow and occurred gradually. The obtained data suggest that T-domain affects internalization and endosomal transport of DT in cells indirectly correlated with their toxin sensitivity. It was concluded that T-domain participates in intracellular endosomal transport and sorting of DT only in toxin-sensitive cells by enhancing the internalization of toxin molecules

Effect of the T-domain on intracellular transport of diphtheria toxin

Subunit B of diphtheria toxin (DT), which consists of two domains: R (receptor-binding) and T (transmembrane), plays an important role in toxin-receptor binding on the cell-targets and in transportation of catalytic subunit A to the cell cytosol. Recombinant analogues of the subunit B are promising representatives in the unique class of transporting proteins, able to deliver different types of biologically active molecules to cell cytosol. In the development of these protein constructs understanding of the role of each of the DT fragments in determination of transporting pathways of endocytosed complex toxin-receptor is urgently required. We have studied in this work the T-domain effect on intracellular transport of recombinant fragments of DT. We have compared intracellular transport of the R-domain and the subunit B, the last one consisted of both R-domain and T-domain. Recombinant fragments of DT used in this work were labeled with fluorescent proteins, which allowed applying colocalization technique for our study. Application of confocal microscopy technique revealed differences in transportation of recombinant derivates of DT in Vero cells: R domain moved faster than subunit B to tubular compartments. Analysis of R-domain and subunit B transportation confirmed almost linear increase of their colocalization with the time regarding to Pearsons correlation coefficient (PCC). However, amount of colocalized with R-domain subunit B were not linearly increased with time according to Manders coefficient (M1), this could indicate the ability of subunit B to transport to such compartments that R-domain do not reach. Possible role of the T-domain in intracellular transportation and compartmentalization of the toxin may be associated with the ability of the T-domain to form a proton channels and its ability to interact with COPI complex

Cell model for the study of receptor and regulatory functions of human proHB-EGF

Developing of new models and approaches, particularly with fluorescent techniques, for investigation of intracellular transport of proHB-EGF and its ligand-receptor complexes is strongly required. In order to create a model for studying proHB-EGF functions the genetic construction pEGFP-N1-proHB-EGF, encoding proHB-EGF-EGFP which is fluorescent-labeled form of proHB-EGF with enhanced green fluorescent protein EGFP in the cytoplasmic terminus of the molecule, was obtained. Eukaryotic cells expressing fusion protein proHB-EGF-EGFP on the cell surface were obtained by transfection with pEGFP-N1-proHB-EGF. Expressed in the Vero cells proHB-EGF-EGFP could bind fluorescent derivative of nontoxic receptor-binding subunit B of diphtheria toxin mCherry-SubB. After stimulation of transfected cells with TPA (12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetate), proHB-EGF-EGFP formed a fluorescentl-labeled C-terminal fragment of the molecule – CTF-EGFP. Thus, the obtained genetic construction pEGFP-N1-proHB-EGF could be helpful in visualization of molecules proHB-EGF and CTF in cells, may open new possibilities for the studying of their functions, such as receptor function of proHB-EGF for diphtheria toxin, intracellular translocation of CTF and provide possibilities for natural proHB-EGF ligands search