Necroptosis and apoptosis in the primate ovary

The ovary is one of the most dynamic organs in the human body, bearing resting, developing and dying follicles as well as the corpus luteum (CL). This is a temporary endocrine gland, which develops after ovulation, produces hormones (e.g. progesterone), but eventually regresses. Accordingly, controlled cell death events in ovarian follicles and the CL are inevitably for reproduction and, consequently, make life feasible. However, the underlying mechanisms of cell death in the human ovary mostly remain elusive. One reason for this lack of knowledge is the poor accessibility of translational models. Human luteinized granulosa cells (LGCs) from patients undergoing in vitro fertilization (IVF) are assumed to offer a good model for the primate CL. LGCs produce progesterone during the first days of culture. Eventually, they lose this ability and die like their counterparts in vivo. While apoptosis represents one way for the CL to die, necroptosis – a form of programmed cell death (PCD) – was recently discovered in LGC culture as another possibility. The present work manifests necroptosis in the CL of humans, common marmosets (Callithrix jacchus) and rhesus macaques (Macaca mulatta) in situ. In the latter it was only evident in the late stages, suggesting necroptosis during luteal regression. Resemblance of transcriptomic and proteomic data of in vivo derived monkey CL and in vitro cultured human LGCs, confirmed these cells as a suitable model. Interestingly, both datasets demonstrated coherent upregulation of the ceramide (CER, N-acyl-sphingosine) salvage pathway over culture and in the late CL. Recently, CER was shown to induce necroptosis in other cellular systems. Consistently, the addition of a synthetical analog of this lipid to the LGC culture led to elevated signs of necroptosis in the present study. Furthermore, the pharmacological reduction of the cellular CER content indicated the opposite effect by improving LGC viability. In contrast to follicular granulosa cells (GCs) in vivo, isolated LGCs do not proliferate in culture. Subsequently, these cells are inappropriate to study necroptosis during follicle development. 3D-cultured monkey follicles are well suited to discover mechanisms in dividing follicular GCs. With the present work, necroptosis was verified in this system and blocking the aforementioned type of PCD was shown to improve follicular growth. Further exploring in this setting, the trophic action of acetylcholine was confirmed, which represents a substantial local signaling factor within the ovary. During follicular development, many follicles grow but only one becomes mature. The other follicles eventually become atretic and perish. In some rare settings, the cell death events involved are evaded by degenerated GCs. A consequence can be the development of granulosa cell tumors (GCT), for which surgery has so far been the only effective treatment method. The idea to “trick” the endogenous inhibitor of apoptosis proteins (IAPs) by analogs of the second mitochondria-derived activator of caspases (SMAC) yields new treatment options. In the present work, heterogenous expression of the IAP machinery in GCTs and a model cell line (KGN) was confirmed and apoptosis was successfully induced by the SMAC mimetic BV6 in this cell line. Collectively, the data suggest necroptosis as a physiological event during follicular development, as well as in luteal regression, and link the latter to the CER salvage pathway. Further, a proof of concept that SMAC mimetics are capable to induce apoptosis in a GCT cell line is provided. In the future, these findings might help patients suffering from GCTs, improve IVF outcome by opposing luteal dysfunction or render targets for fertility control by affecting CL lifetime.Das Ovar ist eines der dynamischsten Organe im menschlichen Körper. Es enthält neben den ruhenden, wachsenden und sterbenden Follikeln auch das corpus luteum (CL). Dieses ist eine temporäre endokrine Drüse, die nach dem Eisprung entsteht, um Hormone (z.B. Progesteron) zu produzieren. Im Laufe des Zyklus bildet sich das CL jedoch wieder zurück. Demnach sind die kontrollierten Zelltodvorgänge, die die ovariellen Follikel und das CL regulieren, unausweichlich für die Fortpflanzung, die wiederum das Leben überhaupt erst möglich macht. Nichtsdestotrotz sind die Mechanismen, die im menschlichen Ovar für diese Vorgänge verantwortlich sind, weitestgehend unbekannt. Ein Grund für diese Wissenslücke ist der Mangel an Modellen, die auf den Menschen übertragbar sind. Es wird angenommen, dass humane luteinisierte Granulosazellen (LGCs) von Patientinnen, die sich einer künstlichen Befruchtung (IVF) unterziehen, ein gutes Modell für das CL von Primaten darstellen. Während der ersten Tage in Kultur produzieren LGCs Progesteron, schließlich verlieren sie diese Fähigkeit jedoch und sterben, genau wie ihr Gegenstück in vivo. Während die Apoptose ein bereits bekannter Zelltodmechanismus im CL ist, kam vor kurzem mit der Entdeckung der Nekroptose – einer Form des programmierten Zelltods (PCD) – in der LGC Kultur eine weitere Möglichkeit auf. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass auch in den CL von Menschen, Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus) und Rhesusaffen (Macaca mulatta) Nekroptose vorkommt. Bei der zuletzt genannten Spezies war diese Zelltodform nur im späten CL ersichtlich, was bedeuten könnte, dass Nekroptose eine Rolle während der Luteolyse spielt. Die Ähnlichkeit zwischen den Transkriptomdaten von in vivo gereiften Affen CL und den Proteomdaten von in vitro kultivierten LGCs bestätigte dabei die gute Übertragbarkeit des verwendeten Modellsystems. Interessanterweise war in beiden Datensätzen der Ceramid (CER, N-Acyl-Sphingosin) Recycling Signalweg sowohl über die Kulturzeit als auch im späten CL hochreguliert. Vor kurzem wurde in anderen zellulären Systemen gezeigt, dass CER Nekroptose auslöst. Damit übereinstimmend führte die Zugabe eines synthetischen Analogons dieses Lipids zur LGC Kultur in der vorliegenden Arbeit zu mehr Nekroptose. Im Gegensatz dazu verbesserte die pharmakologische Senkung des zellulären CER Spiegels die Vitalität der LGCs. Anders als die follikulären Granulosazellen (GCs) in vivo, teilen sich isolierte LGCs nicht in Kultur. Aus diesem Grund ist dieses Modell ungeeignet, um die Nekroptose während der Follikelentwicklung zu studieren. Im Gegensatz dazu stellen 3D kultivierte Affenfollikel ein passendes Modell dar, um die Mechanismen in sich teilenden, follikulären GCs zu verstehen. In der vorliegenden Arbeit konnte in diesem Modellsystem Nekroptose nachgewiesen werden und gleichzeitig gezeigt werden, dass das Blockieren dieses PCD zu verbessertem Follikelwachstum führt. Zusätzlich konnte die trophische Aktivität von Acetylcholin, einem wichtigen Signalfaktor im Ovar, bestätigt werden. Während der Follikelentwicklung wachsen viele Follikel, jedoch reift nur ein einzelner zum Graafschen Follikel heran. Die anderen werden atretisch und sterben schließlich. In seltenen Fällen umgehen entartete GCs jedoch den damit verbundenen Zelltod, was dazu führen kann, dass sich ein Granulosazelltumor (GCT) entwickelt. Derzeit gilt die operative Entfernung des GCTs als die einzige kurative Behandlungsmaßnahme. Die Idee künstliche sekundäre mitochondriale Caspase-Aktivatoren (SMAC) einzusetzen, um endogene Apoptose-Inhibitor-Proteine (IAPs) „auszutricksen“, liefert neue Behandlungsmöglichkeiten. In der aktuellen Arbeit konnte gezeigt werden, dass die IAP-Maschinerie sowohl heterogen in GCTs als auch in einer Modellzelllinie (KGN) exprimiert wird und dass Apoptose in KGN durch das SMAC-Mimetikum BV6 ausgelöst werden kann. Die vorliegende Arbeit legt den Schluss nahe, dass Nekroptose ein physiologisches Ereignis während der Follikelentwicklung und der Luteolyse ist und dass der zuletzt genannte Prozess in Verbindung mit dem CER-Signalweg steht. Zusätzlich wird der Machbarkeitsnachweis dafür geliefert, dass SMAC-Mimetika in der Lage sind, Apoptose in einer GCT-Zellline auszulösen. Zukünftig könnten diese Ergebnisse genutzt werden, um GCT-Patientinnen zu helfen, die IVF-Erfolgschancen durch die Bekämpfung der lutealen Dysfunktion zu erhöhen oder um neue Zielmoleküle für die Schwangerschaftsverhütung zu liefern, die die Lutealphase verkürzen

Necroptosis and apoptosis in the primate ovary

The ovary is one of the most dynamic organs in the human body, bearing resting, developing and dying follicles as well as the corpus luteum (CL). This is a temporary endocrine gland, which develops after ovulation, produces hormones (e.g. progesterone), but eventually regresses. Accordingly, controlled cell death events in ovarian follicles and the CL are inevitably for reproduction and, consequently, make life feasible. However, the underlying mechanisms of cell death in the human ovary mostly remain elusive. One reason for this lack of knowledge is the poor accessibility of translational models. Human luteinized granulosa cells (LGCs) from patients undergoing in vitro fertilization (IVF) are assumed to offer a good model for the primate CL. LGCs produce progesterone during the first days of culture. Eventually, they lose this ability and die like their counterparts in vivo. While apoptosis represents one way for the CL to die, necroptosis – a form of programmed cell death (PCD) – was recently discovered in LGC culture as another possibility. The present work manifests necroptosis in the CL of humans, common marmosets (Callithrix jacchus) and rhesus macaques (Macaca mulatta) in situ. In the latter it was only evident in the late stages, suggesting necroptosis during luteal regression. Resemblance of transcriptomic and proteomic data of in vivo derived monkey CL and in vitro cultured human LGCs, confirmed these cells as a suitable model. Interestingly, both datasets demonstrated coherent upregulation of the ceramide (CER, N-acyl-sphingosine) salvage pathway over culture and in the late CL. Recently, CER was shown to induce necroptosis in other cellular systems. Consistently, the addition of a synthetical analog of this lipid to the LGC culture led to elevated signs of necroptosis in the present study. Furthermore, the pharmacological reduction of the cellular CER content indicated the opposite effect by improving LGC viability. In contrast to follicular granulosa cells (GCs) in vivo, isolated LGCs do not proliferate in culture. Subsequently, these cells are inappropriate to study necroptosis during follicle development. 3D-cultured monkey follicles are well suited to discover mechanisms in dividing follicular GCs. With the present work, necroptosis was verified in this system and blocking the aforementioned type of PCD was shown to improve follicular growth. Further exploring in this setting, the trophic action of acetylcholine was confirmed, which represents a substantial local signaling factor within the ovary. During follicular development, many follicles grow but only one becomes mature. The other follicles eventually become atretic and perish. In some rare settings, the cell death events involved are evaded by degenerated GCs. A consequence can be the development of granulosa cell tumors (GCT), for which surgery has so far been the only effective treatment method. The idea to “trick” the endogenous inhibitor of apoptosis proteins (IAPs) by analogs of the second mitochondria-derived activator of caspases (SMAC) yields new treatment options. In the present work, heterogenous expression of the IAP machinery in GCTs and a model cell line (KGN) was confirmed and apoptosis was successfully induced by the SMAC mimetic BV6 in this cell line. Collectively, the data suggest necroptosis as a physiological event during follicular development, as well as in luteal regression, and link the latter to the CER salvage pathway. Further, a proof of concept that SMAC mimetics are capable to induce apoptosis in a GCT cell line is provided. In the future, these findings might help patients suffering from GCTs, improve IVF outcome by opposing luteal dysfunction or render targets for fertility control by affecting CL lifetime.Das Ovar ist eines der dynamischsten Organe im menschlichen Körper. Es enthält neben den ruhenden, wachsenden und sterbenden Follikeln auch das corpus luteum (CL). Dieses ist eine temporäre endokrine Drüse, die nach dem Eisprung entsteht, um Hormone (z.B. Progesteron) zu produzieren. Im Laufe des Zyklus bildet sich das CL jedoch wieder zurück. Demnach sind die kontrollierten Zelltodvorgänge, die die ovariellen Follikel und das CL regulieren, unausweichlich für die Fortpflanzung, die wiederum das Leben überhaupt erst möglich macht. Nichtsdestotrotz sind die Mechanismen, die im menschlichen Ovar für diese Vorgänge verantwortlich sind, weitestgehend unbekannt. Ein Grund für diese Wissenslücke ist der Mangel an Modellen, die auf den Menschen übertragbar sind. Es wird angenommen, dass humane luteinisierte Granulosazellen (LGCs) von Patientinnen, die sich einer künstlichen Befruchtung (IVF) unterziehen, ein gutes Modell für das CL von Primaten darstellen. Während der ersten Tage in Kultur produzieren LGCs Progesteron, schließlich verlieren sie diese Fähigkeit jedoch und sterben, genau wie ihr Gegenstück in vivo. Während die Apoptose ein bereits bekannter Zelltodmechanismus im CL ist, kam vor kurzem mit der Entdeckung der Nekroptose – einer Form des programmierten Zelltods (PCD) – in der LGC Kultur eine weitere Möglichkeit auf. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass auch in den CL von Menschen, Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus) und Rhesusaffen (Macaca mulatta) Nekroptose vorkommt. Bei der zuletzt genannten Spezies war diese Zelltodform nur im späten CL ersichtlich, was bedeuten könnte, dass Nekroptose eine Rolle während der Luteolyse spielt. Die Ähnlichkeit zwischen den Transkriptomdaten von in vivo gereiften Affen CL und den Proteomdaten von in vitro kultivierten LGCs bestätigte dabei die gute Übertragbarkeit des verwendeten Modellsystems. Interessanterweise war in beiden Datensätzen der Ceramid (CER, N-Acyl-Sphingosin) Recycling Signalweg sowohl über die Kulturzeit als auch im späten CL hochreguliert. Vor kurzem wurde in anderen zellulären Systemen gezeigt, dass CER Nekroptose auslöst. Damit übereinstimmend führte die Zugabe eines synthetischen Analogons dieses Lipids zur LGC Kultur in der vorliegenden Arbeit zu mehr Nekroptose. Im Gegensatz dazu verbesserte die pharmakologische Senkung des zellulären CER Spiegels die Vitalität der LGCs. Anders als die follikulären Granulosazellen (GCs) in vivo, teilen sich isolierte LGCs nicht in Kultur. Aus diesem Grund ist dieses Modell ungeeignet, um die Nekroptose während der Follikelentwicklung zu studieren. Im Gegensatz dazu stellen 3D kultivierte Affenfollikel ein passendes Modell dar, um die Mechanismen in sich teilenden, follikulären GCs zu verstehen. In der vorliegenden Arbeit konnte in diesem Modellsystem Nekroptose nachgewiesen werden und gleichzeitig gezeigt werden, dass das Blockieren dieses PCD zu verbessertem Follikelwachstum führt. Zusätzlich konnte die trophische Aktivität von Acetylcholin, einem wichtigen Signalfaktor im Ovar, bestätigt werden. Während der Follikelentwicklung wachsen viele Follikel, jedoch reift nur ein einzelner zum Graafschen Follikel heran. Die anderen werden atretisch und sterben schließlich. In seltenen Fällen umgehen entartete GCs jedoch den damit verbundenen Zelltod, was dazu führen kann, dass sich ein Granulosazelltumor (GCT) entwickelt. Derzeit gilt die operative Entfernung des GCTs als die einzige kurative Behandlungsmaßnahme. Die Idee künstliche sekundäre mitochondriale Caspase-Aktivatoren (SMAC) einzusetzen, um endogene Apoptose-Inhibitor-Proteine (IAPs) „auszutricksen“, liefert neue Behandlungsmöglichkeiten. In der aktuellen Arbeit konnte gezeigt werden, dass die IAP-Maschinerie sowohl heterogen in GCTs als auch in einer Modellzelllinie (KGN) exprimiert wird und dass Apoptose in KGN durch das SMAC-Mimetikum BV6 ausgelöst werden kann. Die vorliegende Arbeit legt den Schluss nahe, dass Nekroptose ein physiologisches Ereignis während der Follikelentwicklung und der Luteolyse ist und dass der zuletzt genannte Prozess in Verbindung mit dem CER-Signalweg steht. Zusätzlich wird der Machbarkeitsnachweis dafür geliefert, dass SMAC-Mimetika in der Lage sind, Apoptose in einer GCT-Zellline auszulösen. Zukünftig könnten diese Ergebnisse genutzt werden, um GCT-Patientinnen zu helfen, die IVF-Erfolgschancen durch die Bekämpfung der lutealen Dysfunktion zu erhöhen oder um neue Zielmoleküle für die Schwangerschaftsverhütung zu liefern, die die Lutealphase verkürzen

Human Luteinized Granulosa Cells—A Cellular Model for the Human Corpus Luteum

In the ovary, the corpus luteum (CL) forms a temporal structure. Luteinized mural granulosa cells (GCs), which stem from the ruptured follicle, are the main cells of the CL. They can be isolated from follicular fluid of woman undergoing in vitro fertilization. In culture, human GCs are viable for several days and produce progesterone, yet eventually steroid production stops and GCs with increasing time in culture undergo changes reminiscent of the ones observed during the demise of the CL in vivo. This short review summarizes the general use of human GCs as a model for the primate CL and some of the data from our lab, which indicate that viability, functionality, survival and death of GCs can be regulated by local signal molecules (e.g., oxytocin and PEDF) and the extracellular matrix (e.g., via the proteoglycan decorin). We further summarize studies, which identified autophagocytotic events in human GCs linked to the activation of an ion channel. More recent studies identified a form of regulated cell death, namely necroptosis. This form of cell death may, in addition to apoptosis, contribute to the demise of the human CL. We believe that human GCs are a unique window into the human CL. Studies employing these cells may lead to the identification of molecular events and novel targets, which may allow to interfere with CL functions

Acetylcholine and necroptosis are players in follicular development in primates

Acetylcholine (ACh) in the ovary and its actions were linked to survival of human granulosa cells in vitro and improved fertility of rats in vivo. These effects were observed upon experimental blockage of the ACh-degrading enzyme (ACH esterase;ACHE), by Huperzine A. We now studied actions of Huperzine A in a three-dimensional culture of macaque follicles. Because a form of programmed necrotic cell death, necroptosis, was previously identified in human granulosa cells in vitro, we also studied actions of necrostatin-1 (necroptosis inhibitor). Blocking the breakdown of ACh by inhibiting ACHE, or interfering with necroptosis, did not improve the overall follicle survival, but promoted the growth of macaque follicles from the secondary to the small antral stage in vitro, which was correlated with oocyte development. The results from this translational model imply that ovarian function and fertility in primates may be improved by pharmacological interference with ACHE actions and necroptosis

Inhibitor of apoptosis proteins are potential targets for treatment of granulosa cell tumors - implications from studies in KGN

BACKGROUND: Granulosa cell tumors (GCTs) are derived from proliferating granulosa cells of the ovarian follicle. They are known for their late recurrence and most patients with an aggressive form die from their disease. There are no treatment options for this slowly proliferating tumor besides surgery and chemotherapy. In a number of tumors, analogs of the second mitochondria-derived activator of caspases (SMAC), alone or in combination with other molecules, such as TNFα, are evolving as new treatment options. SMAC mimetics block inhibitor of apoptosis proteins (IAPs), which bind caspases (e.g. XIAP), or activate the pro-survival NF-κB pathway (e.g. cIAP1/2). Expression of IAPs by GCTs is yet not fully elucidated but recently XIAP and its inhibition by SMAC mimetics in a combination therapy was described to induce apoptosis in a GCT cell line, KGN. We evaluated the expression of cIAP1 in GCTs and elucidated the effects of the SMAC mimetic BV-6 using KGN as a model. RESULTS: Employing immunohistochemistry, we observed cIAP1 expression in a tissue microarray (TMA) of 42 GCT samples. RT-PCR confirmed expression of cIAP1/2, as well as XIAP, in primary, patient-derived GCTs and in KGN. We therefore tested the ability of the bivalent SMAC mimetic BV-6, which is known to inhibit cIAP1/2 and XIAP, to induce cell death in KGN. A dose response study indicated an EC50 ≈ 8 μM for both, early ( 80) passages, which differ in growth rate and presumably aggressiveness. Quantitative RT-PCR showed upregulation of NF-κB regulated genes in BV-6 stimulated cells. Blocking experiments with the pan-caspase inhibitor Z-VAD-FMK indicated caspase-dependence. A concentration of 20 μM Z-VAD-FMK was sufficient to significantly reduce apoptosis. This cell death was further substantiated by results of Western Blot studies. Cleaved caspase 3 and cleaved PARP became evident in the BV-6 treated group. CONCLUSIONS: Taken together, the results show that BV-6 is able to induce apoptosis in KGN cells. This approach may therefore offer a promising therapeutic avenue to treat GCTs

A Role for H2O2 and TRPM2 in the Induction of Cell Death: Studies in KGN Cells

Recent studies showed that KGN cells, derived from a human granulosa cell tumor (GCT), express NADPH oxidase 4 (NOX4), an important source of H2O2. Transient receptor potential melastatin 2 (TRPM2) channel is a Ca2+ permeable cation channel that can be activated by H2O2 and plays an important role in cellular functions. It is also able to promote susceptibility to cell death. We studied expression and functionality of TRPM2 in KGN cells and examined GCT tissue microarrays (TMAs) to explore in vivo relevance. We employed live cell, calcium and mitochondrial imaging, viability assays, fluorescence activated cell sorting (FACS) analysis, Western blotting and immunohistochemistry. We confirmed that KGN cells produce H2O2 and found that they express functional TRPM2. H2O2 increased intracellular Ca2+ levels and N-(p-Amylcinnamoyl)anthranilic acid (ACA), a TRPM2 inhibitor, blocked this action. H2O2 caused mitochondrial fragmentation and apoptotic cell death, which could be attenuated by a scavenger (Trolox). Immunohistochemistry showed parallel expression of NOX4 and TRPM2 in all 73 tumor samples examined. The results suggest that GCTs can be endowed with a system that may convey susceptibility to cell death. If so, induction of oxidative stress may be beneficial in GCT therapy. Our results also imply a therapeutic potential for TRPM2 as a drug target in GCTs

Necroptosis in primate luteolysis: a role for ceramide

The corpus luteum (CL) is a transient endocrine organ, yet molecular mechanisms resulting in its demise are not well known. The presence of phosphorylated mixed lineage kinase domain-like pseudokinase pMLKL(T357/S358) in human and nonhuman primate CL samples (Macaca mulatta and Callithrix jacchus) implied that necroptosis of luteal cells may be involved. In M. mulatta CL, pMLKL positive staining became detectable only from the mid-late luteal phase onwards, pointing to necroptosis during regression of the CL. Cell death, including necroptosis, was previously observed in cultures of human luteal granulosa cells (GCs), an apt model for the study of the human CL. To explore mechanisms of necroptotic cell death in GCs during culture, we performed a proteomic analysis. The levels of 50 proteins were significantly altered after 5 days of culture. Interconnectivity analysis and immunocytochemistry implicated specifically the ceramide salvage pathway to be enhanced. M. mulatta CL transcriptome analysis indicated in vivo relevance. Perturbing endogenous ceramide generation by fumonisin B1 (FB1) and addition of soluble ceramide (C2-CER) yielded opposite actions on viability of GCs and therefore supported the significance of the ceramide pathway. Morphological changes indicated necrotic cell death in the C2-CER treated group. Studies with the pan caspase blocker zVAD-fmk or the necroptosis blocker necrosulfonamid (NSA) further supported that C2-CER induced necroptosis. Our data pinpoint necroptosis in a physiological process, namely CL regression. This raises the possibility that the primate CL could be rescued by pharmacological inhibition of necroptosis or by interaction with ceramide metabolism