Lo studio delle catene leggere libere nelle discrasie plasmacellulari.

Introduzione:Le discrasie plasmacellulari sono un gruppo di patologie caratterizzate dalla proliferazione incontrollata di un clone plasmacellulare che produce una immunoglobulina intera o parte di essa. Tra queste sono presenti patologie francamente neoplastiche come il mieloma multiplo, ma anche la più diffusa gammopatia monoclonale di incerto significato, che viene ritenuta una condizione benigna, ma con una propensione alla trasformazione in neoplasia. Inoltre è compreso in questo gruppo anche l’amiloidosi AL, patologia multiorgano relativamente rara,molto insidiosa e di per sé compresa in un gruppo più ampio dove si riscontrano però diversi meccanismi patogenetici. Il termine amiloidosi infatti fa riferimento a un gruppo eterogeneo di patologie acquisite o ereditarie, localizzate o sistemiche, caratterizzate dalla deposizione extracellulare di proteine fibrillari insolubili, con secondaria alterazione dell’architettura e della funzione dei tessuti coinvolti. L’amiloide deriva dall’assemblarsi di precursori proteici anomali che assumono una struttura secondaria a foglietto β ripiegato e formano depositi fibrillari in associazione con altre sostanze di natura non proteica. Nell’amiloidosi AL la proteina precursore è costituita da catene leggere libere (FLC) delle immunoglobuline. È ancora oscuro il motivo per cui alcune catene leggere possono aggregarsi e dar luogo a depositi di amiloide ed altre no. Lo scopo del nostro studio è quello ditentare di caratterizzare biochimicamente le catene leggere libere kappa e lambda nei pazienti con discrasie plasmacellulari per individuare il loro potenziale amiloidogenico. Materiali e Metodi:Abbiamo dapprima estratto i dati relativi ai soggetti che hanno eseguito il dosaggio delle catene leggere libere nel Laboratorio di Patologia Clinica dell’AOUP dal 1 Agosto 2009 al 31 Dicembre 2014, operando su di essi una analisi descrittiva ed estraendo i dati relativi a pazienti con amiloidosi AL accertata. Abbiamo poi impostato un percorso di caratterizzazione biochimica delle FLC. La separazione e caratterizzazione delle catene leggere libere di campioni di pazienti con discrasia plasmacellulare è stata effettuata mediante cromatografia per esclusione molecolare, tecnica che consente di separare le proteine presenti in un campione in base alla massa molecolare.Dalla cromatografia sono state raccolte delle frazioni di eluato sulle quali è stata eseguita la determinazione delle catene leggere libere mediante nefelometria. Risultati:L’analisi dei dati è stata compiuta su 2303 determinazioni di FLC. La cromatografia e il dosaggio nelle frazioni delle catene leggere su nefelometro con diversi tipi di antisieri ci ha consentito di trarre alcune considerazioni sulla base del riscontro di frazioni reattive di diverso peso molecolare. Conclusioni: Con questo studio preliminare abbiamo iniziato un percorso di caratterizzazione biochimica delle catene leggere libere che abbiamo intenzione di applicare ai campioni di pazienti con amiloidosi AL, dal momento che l’identificazione di caratteristiche proprie di catene leggere amiloidogeniche può permettere di identificare precocemente i pazienti predisposti a sviluppare amiloidosi per poter quindi intraprendere una terapia più efficace

Discrepancy between FLC assays: Only a problem of quantification?

Immunoglobulin light chains not associated with heavy chains (free light chains, FLC) are found in serum. A growing clinical importance has been assigned to the quantification of the kappa and lambda FLC in serum in the management of plasma cell dyscrasias. At present, automated immunoassays are the only available techniques allowing quantitative determination of serum FLC. Unfortunately, the two reagents available for FLC assay, provide sometimes divergent results. It has been proposed that the different results, unpredictably affecting individual serum samples, are due the different reactivity of reagents against FLC oligomers that are known to be present to a variable extent in serum, especially when lambda FLC are involved. We report a case where we demonstrated that the two reagents recognized differently FLC monomer and dimers

DISCREPANTI DOSAGGI DI CATENE LEGGERE LIBERE IN PLASMA E URINE IN UN CASO DI DISCRASIA PLASMACELLULARE CLONALE NON MIELOMATOSA TRATTATA CON PLASMAEXCHANGE

Le gammopatie monoclonali includono uno spettro eterogeneo di disordini plasmacellulari ad insorgenza tardiva che variano da forme premaligne, quali la gammopatia monoclonale di significato incerto e il mieloma multiplo asintomatico, a forme maligne, quali il plasmacitoma solitario, il mieloma multiplo, l’amiloidosi a catene leggere e la macroglobulinemia di Waldenstrom. Nelle linee guida prodotte dall’International MyelomaWorking Group gli esami fondamentali per l’individuazione delle discrasie plasmacellulari sono l’elettroforesi delle proteine sieriche, l’immunofissazione sierica e la determinazione quantitativa delle catene leggere libere delle immunoglobuline nel siero (sFLC). La determinazione sFLC ha assunto un ruolo consolidato nella diagnosi, valutazione della prognosi nelle diverse discrasie plasmacellulari. I reattivi maggiormente utilizzati per la determinazione automatizzata delle FLC sono la Freelite® della TheBindingSite e il reattivo N Latex FLC della Siemens. Pur dimostrando entrambi una buona specificità nei confronti del loro target, sono note possibili discrepanze nei valori di catene leggere libere misurate nel siero di pazienti con patologia primaria plasmacellulare clonale. Descriviamo un caso clinico che evidenzia come tale discrepanza possa rivelarsi anche in patologia linfoproloferative diverse, rendendosi evidenti sia su plasma che su urine. Paziente di 56 anni nel 2010 fu diagnosticata la leucemia linfatica cronica (LLC) trattata con schema terapeutico tradizionale. Nel 2014 manifestò riacutizzazione di malattia con linfocitosi, piastrinopenia, splenomegalia e linfoadenopatie sopra e sottodiaframmatiche. Le indagini midollari evidenziarono massiva infiltrazione di elementi linfoidi secernenti IgM kappa. Dal gennaio del 2018 il tracciato elettroforetico mostrò un incremento del picco in zona beta 2/gamma e della componente monoclonale (CM) IgM (5760 mg/dl), tranciato elettroforetico delle siero proteine mostrava il picco in zona beta2-gamma. La paziente manifestò sintomi da iperviscosità con comparsa di epistassi e alterazione del campo visivo. Date le elevate IgM iniziò il ciclo di trattamento con plasma exchange (PEx) bisettimanale e immuno-chemio terapia. Il ciclo di PEx iniziò scambiando 1 volemia con Albumina al 5%, riservando l’uso del plasma al compenso delle alterazioni coagulative. In occasione delle sedute di plasma exchange vengono raccolti campioni sui quali sono eseguite ulteriori analisi. Sul campione prelevato prima delle sedute di plasma exchange (8 Aprile 2019) le IgM sono 9320 mg/dl, e l’immunofissazione sierica evidenzia componente monoclonale IgM kappa. Dopo plasma exchange le IgM sono ridotte a 5950 mg/dl. Le FLC kappa plasmatiche, misurate rispettivamente con il reattivo Freelite® della TheBindingSite e con il reattivo N Latex FLC della Siemens su nefelometro BNII, prima del plasma exchange sono 6,3 mg/dl e 64 mg/dl, mentre dopo la seduta di plasma exchange 5,65 mg/dl e 52,6 mg/dl evidenziando una discrepanza tra i due reattivi. Il plasma, sottoposto a Western blot sviluppato con anti-kappa, evidenzia la banda corrispondente alle IgM e le FLC presenti prevalentemente come monomero. La discrepanza osservata sui risultati ottenuti nel plasma si conferma sul campione di urine raccolto nella stessa data, nel quale l’immunofissazione evidenzia abbondanti catene leggere di tipo kappa: le FLC misurate con Freelite® risultano 200 mg/dl, e con N Latex FLC 811 mg/dl. Anche il campione di urina sottoposto a SDS-PAGE e WB evidenzia FLC in forma prevalentemente monomerica. Il campione di urina, sottoposto a LC-MS, ha permesso di determinare con esattezza il peso molecolare del monomero, che è risultato di 24605 Da. Il caso descritto riporta una discrepanza di risultati tra due reattivi per le FLC in una paziente con discrasia plasmacellulare non mielomatosa sottoposta alla terapia con plasma exchange. I risultati sembrano inoltre suggerire che le caratteristiche delle FLC che condizionano la differente reattività nel plasma sembrano mantenersi nel campione urinario

Different immunoreactivity of monomers and dimers makes automated free light chains assays not equivalent.

Background The automated immunochemical serum free light chains (FLC) assays, Freelite (a polyclonal antiserum) and N Latex FLC (a mixture of monoclonal antibodies), are not interchangeable, as they may provide different results on a same sample. This study was aimed to establish if the calibrators contain FLC oligomers, and if different reactivity against monomers and dimers contributes to the discrepancy. Methods Gel filtration chromatography fractions of the calibrators were subjected to a Western blot (WB) and analyzed by each reagent. The procedure was repeated after pretreating the N Latex FLC calibrator with the reducing agent dithiothreitol (DTT). Results Both calibrators contain FLC dimers and monomers. Both reagents detect (with different sensitivity) FLC kappa monomers and dimers; instead, Freelite detects only FLC lambda dimers, while N Latex FLC detects only FLC monomers. After DTT treatment, only the N Latex lambda still detects FLC with reduced protein thiols, while the reactivity of all other reagents is abolished. Conclusions Due to their different reactivity against FLC monomers and oligomers, the Freelite and N Latex FLC are calibrated against different components of their own calibrators, making the two reagents not equivalent. The redox status of FLC determines the immunoreactivity not only of FLC dimers, but also of the monomers