Achievements and new knowledge unraveled by metagenomic approaches

Metagenomics has paved the way for cultivation-independent assessment and exploitation of microbial communities present in complex ecosystems. In recent years, significant progress has been made in this research area. A major breakthrough was the improvement and development of high-throughput next-generation sequencing technologies. The application of these technologies resulted in the generation of large datasets derived from various environments such as soil and ocean water. The analyses of these datasets opened a window into the enormous phylogenetic and metabolic diversity of microbial communities living in a variety of ecosystems. In this way, structure, functions, and interactions of microbial communities were elucidated. Metagenomics has proven to be a powerful tool for the recovery of novel biomolecules. In most cases, functional metagenomics comprising construction and screening of complex metagenomic DNA libraries has been applied to isolate new enzymes and drugs of industrial importance. For this purpose, several novel and improved screening strategies that allow efficient screening of large collections of clones harboring metagenomes have been introduced

Finding the Needles in the Metagenome Haystack

In the collective genomes (the metagenome) of the microorganisms inhabiting the Earth’s diverse environments is written the history of life on this planet. New molecular tools developed and used for the past 15 years by microbial ecologists are facilitating the extraction, cloning, screening, and sequencing of these genomes. This approach allows microbial ecologists to access and study the full range of microbial diversity, regardless of our ability to culture organisms, and provides an unprecedented access to the breadth of natural products that these genomes encode. However, there is no way that the mere collection of sequences, no matter how expansive, can provide full coverage of the complex world of microbial metagenomes within the foreseeable future. Furthermore, although it is possible to fish out highly informative and useful genes from the sea of gene diversity in the environment, this can be a highly tedious and inefficient procedure. Microbial ecologists must be clever in their pursuit of ecologically relevant, valuable, and niche-defining genomic information within the vast haystack of microbial diversity. In this report, we seek to describe advances and prospects that will help microbial ecologists glean more knowledge from investigations into metagenomes. These include technological advances in sequencing and cloning methodologies, as well as improvements in annotation and comparative sequence analysis. More significant, however, will be ways to focus in on various subsets of the metagenome that may be of particular relevance, either by limiting the target community under study or improving the focus or speed of screening procedures. Lastly, given the cost and infrastructure necessary for large metagenome projects, and the almost inexhaustible amount of data they can produce, trends toward broader use of metagenome data across the research community coupled with the needed investment in bioinformatics infrastructure devoted to metagenomics will no doubt further increase the value of metagenomic studies in various environments

Construction and Screening of metagenomic DNA libraries: Identification and characterization of genes and gene products of oxidoreductases and B12 dependent dehydratases involved in polyol metabolism

Eine neue Möglichkeit zur Erforschung der großen metabolischen und genetischen Diversität von Mikroorganismen ist die Konstruktion von Genbanken direkt aus Umweltproben. Zur Identifizierung neuer Gene für Koenzym B12-abhängige Glycerin-und Diol-Dehydratasen wurden vier sogenannte Metagenom-Banken hergestellt. Als Proben wurde Boden eines Zuckerrübenfeldes, Sediment des Flusses Grone (beide nahe Göttingen, Deutschland), Sediment des Solar Lake (Ägypten) und Sediment des Golfs von Eilat (Isarel) verwendet. Die Durchmusterung auf Glycerin- und Diol-Dehydratasen basierte auf der Komplementation eines konstruierten Dehydratase-negativen E. coli Stammes. Des weiteren wurde die Methode der Koloniehybridisierung mit Dehydratase-spezifischen DNA-Fragmenten genutzt. Die Untersuchung von ca. 720 000 E. coli-Klonen erbrachte sieben positive Klone (E. coli pAK2 - pAK8). Zwei der Plasmide beinhalteten Dehydratase-Gene, identisch zu denen aus Citrobacter freundii und wurden daher nicht weiter untersucht. Drei der verbleidenden fünf Plasmide codierten für Glycerin-, zwei für Diol-Dehydratasen. Mit zwei der Glycerin-Dehydratasen und einer komplementierten Diol-Dehydratasen wurde eine Überproduktion und eine Reinigung der Enzyme durchgeführt. Die Enzyme unterlagen einer sogenannten suicide -Inaktivierung durch Glycerin, konnten aber durch den Reaktivierungsfaktor (DhaFG) der Glycerin-Dehydratase aus C. freundii kreuz-reaktiviert werden. Alle untersuchen Dehydratasen unterlagen außerdem einer Inaktivierung durch das Glycerin-Fermentationsprodukt 1,3-Propandiol.Etwa 300 000 E.coli-Klone der oben genannten Genbanken wurden auf Indikatoragar auf die Bildung von Carbonylen aus Polyolen untersucht. 16 aus ursprünglich 24 positiven E. coli-Klonen beinhalteten Plasmide (pAK101 bis pAK116) die einen stabilen Phänotyp vermittelten. Acht der positiven Klone zeigten NAD(H)-abhängige Alkohol-Oxidoreduktase-Aktivität mit Polyolen oder Carbonylen als Substrat. Durch die Sequenzierung konnten auf den Inserts der Plasmide 36 vollständige und 17 unvollständige, potentielle Gene identifiziert werden. Die für die Carbonyl-Bildung verantwortlichen Gene konnten für neun der Plasmide identifziert werden. Die Analyse der abgeleiteten Aminosäuresequenzen ergab, dass drei Gene (orf12, orf14 und orf22) neue Alkohol-Dehydrogenasen kodierten, vier (orf5, sucB, fdhD, und yabF) kodieren zwei mögliche Oxidoreductasen, die nicht zu den Alkohol-Dehydrogenasen gehören, eines (glkP) kodierte eine Glycerin-Kinase und eines (orf1) kodierte für eine Protein, das keinerlei Homologie zu bisher bekannten Genprodukten zeigte. Weitere 24 positive Klone wurden bei der Durchmusterung von drei bereits bestehenden Genbanken erhalten. 15 Klone enthielten Plasmide, die einen stabilen Phänotyp in E. coli vermittelten. Diese wurden mit pAK201-215 bezeichnet. Die weitere Analyse konzentrierte sich auf 7 Plasmide, die eine NAD(H)-abhängige Alkohol-Oxidoreduktase-Aktivität vermittelten. Durch Subklonierung konnten drei für den Phänotyp verantwortliche Gene (orf6, orf24 und orf25) identifiziert werden. Die Sequenzen zeigten keine signifikante Ähnlichkeit zu bekannten Alkohol-Oxidoreduktasen, sie beinhalteten jedoch Glycin-reiche Regionen, die typisch für die Bindung von Nikotinamid-Kofaktoren sind