Characterization of apoptotic cells induced in vitro in Meckel\u27s chondrocytes by anticancer agents

抗癌剤のエトポシトとカンプトセシンによってメッケル軟骨に誘導される細脳死かアポトーシスによるものか否かを検索した。細脳死は胎生16日のマウスから分離した培養メッケル軟骨にエトポシト(200μg/ml)とカンプトセシン(50μg/ml)によって誘導した。これらの効果はTUNEL法と光顕およひ電顕に加え、免疫組織化学的に解析した。エトポント処理した培養細胞はアポトーシスの指標となる多くのTUNEL陽性細胞を示した。微細構造的にエトポシトてのアポトーシス様の細脳死は細脳性出芽、核クロマチンの濃縮、アポトーシス小体の形成によって引き続かれた。これに対し、カンプトセシンによる細脳死はエトポシトと同様にTUNEL陽性細胞の増加を示した。これらの抗癌剤処理後のアポトーシスは時間依存的に増加し、特に、12時間後から急速に増加した。P53の免疫染色では、この蛋白は正常な培養軟骨細胞では陰性であったか、エトポノトとカンプトセシン処理群では恒常的に促進された。一方、bcl-2の反応は培養初期の正常軟骨細胞に局在したが、抗癌剤処理群では認められなかった。本研究から、エトポシトとカンプトセシンによってメッケル軟骨に誘導された細脳死は典型的なアポトーシスによる細脳死で、これらの抗癌刻は腫瘍細胞のみならす、正常な軟骨細脳にもアポトーシスを誘導することか示唆された。Cell death induced in Meckel\u27s chondrocytes in vitro with the anticancer drugs, etoposide and camptothecin, was examined from the viewpoint of an apoptotic event. Cell death was induced in vitro in Meckel\u27s chondrocytes that were enzymatically isolated from 16-day gestation mouse embryos. The effects were assayed histologically and immunohistochemically by using the TUNEL procedure, and light and electron microscopy. Etoposide and camptothecin-treated cultures were followed by the strong appearance of TUNEL (TdT-mediated biotinylated dUTP nick end-labeling)-positive apoptotic cells; statistical analysis showed that these agents induced apoptosis significantly 12-24hrs after treatment. At an ultrastructural level, apoptotic cell death from etoposide was followed by the formation of cell blebs, chromatin condensation and the formation of apoptotic bodies. Immunostaining for p53 revealed that this protein was absent from intact chondrocytes but was continuously accelerated in the cells treated with etoposide and camptothecin. Bcl- 2 was immunolocalized in intact chondrocytes at an early stage of culture, but was not detected in anticancer-treated cells. In the present study, we confirmed that cell death in Meckel\u27s chondrocytes induced by etoposide and camptothecin is typical apoptotic cell death, and that these agents also induce apoptosis in intact chondrocytes

Pharmacological effects of sex steroid hormones on lipogenesis in Meckel\u27s chondrocytes in vitro

ニワトリ血清(CKS)はメッケル軟骨細胞に脂肪形成を促進する因子を含んでいる。本研究では, CKSのホルモン分析の結果から得られたような高レベルの性ホルモンが培養メッケル軟骨細胞の脂肪形成にどの様に関わっているのか検討した。培養軟骨細胞は生理的ないし薬理的濃度のテストステロンと17β-エストラジオール(E_2)を含む数種の性ホルモンで添加培養し, 脂肪滴形成能をズダン染色によって評価した。最も脂肪形成能の高かったテストステロンとE_2については, 電子顕微鏡, 免疫染色とBrdUの取込みから細胞増殖率を算定した。その結果, 生理的濃度でのテストステロンとE_2は細胞増殖を促進したが, 脂肪形成は促進しなかった。高濃度では両者のホルモンは脂肪形成を亢進した。形成された脂肪細胞はレプチン, GPDHやC/EBPα抗体による免疫染色では陽性であった。これらの結果から, テストステロンとE_2は薬理学的作用として脂肪形成能を有しているが, 生理的条件下では脂肪形成そのものより未分化型細胞での細胞増殖を刺激している可能性が示唆された。Chick serum (CKS) contains factors that stimulate adipocyte induction in Meckel\u27s chondrocytes in vitro. In the present study, we examined whether sex hormones as shown by the analysis of hormonel level in CKS have the capacity to induce lipogenesis in Meckel\u27s chondrocytes in vitro. Cultures were treated with different sex hormones at physiological and pharmacological concentrations, including testosterone and 17β-estradiol (E_2). Lipogenesis was evaluated by sudan staining. Testosterone and E_2, which were the two most effective hormones, were selected for the present study and their effects were further examined by histological and immunohistochemical methods, including immunolocalization of adipocyte markers. BrdU-incorporation in cells exposed to physiological concentration of E_2 and testosterone was increased compared to control cultures, but there was no significant difference in BrdU-incorporation in cultures treated with E_2 and testosterone. However, at pharmacological concentrations, these hormones induced dose-dependent lipogenesis in Meckel\u27s chondrocytes. Almost all the lipid droplet-containing cells were positive for leptin, α-glycerophosphate dehydrogenase (GPDH), and CCAAT-enhancer binding protein (C/EBPα), as shown by immunoperoxidase staining. Testosterone and E_2 had no capacity to induce lipogenesis in Meckel\u27s chondrocytes at physiological concentrations, but our results suggest that they have the potential for lipogenesis as a pharmacological effect

Effects of elcatonin on matrix calcification of Meckel\u27s cartilage in vitro

ウナギ由来のエルカトニン(ELC)は優れた薬理学的効能から実験的ないし臨床試験的改善薬として骨粗鬆症患者に投与され良好な成績が得られている。本実験では,胎生17日マウスメッケル軟骨に対するELCの効果を細胞培養と器官培養を用いて解析した。細胞培養と器官培養のためのメッケル軟骨は以下の4種類の培養液で最長4週間まで培養した。培養液として,培養液1;イーグル培地(α-MEM),培養液2;α-MEM+β-グリセロリン酸(β-Gly),培養液3;α-MEM+ELCと培養液4;α-MEM+β-Gly+ELCを用いた。試料はアルカリフォスファターゼ(ALPase)とbromodeoxyuridine (BrdU)の取り込みを含む組織学,組織化学的方法によって解析した。ELCを含む培養液は,より効果的に石灰化を誘導することがホン・コッサ染色によって示された。BrdUの取り込みによる細胞増殖率は,培養液1と3との間では有意差が認められなかった。ALPase活性は,基質の石灰化に先駆けて促進されることが細胞培養と器官培養での組織化学と蛍光免疫染色によって確認された。ELCはβ-Glyとほぼ同等量のALPaseを発現し,さらにELCとβ-Glyを含む培養液4では相乗的にALPase活性と石灰化を誘導した。本研究の結果から,ELCはメッケル軟骨細胞のALPase活性を促進し,その後の石灰化の誘導因子として作用する可能性が示唆された。The effects of elcatonin (ELC) on Meckel\u27s cartilage obtained from 17-day embryonic mice were investigated using cell and organ cultures. Specimens for cell and organ cultures were cultured for 4 weeks in different media as follows: Control medium, alpha-modified Eagle\u27s medium (α-MEM); β-Gly medium, α-MEM plus β-glycerophosphate (β-Gly); ELC medium,α-MEM plus ELC; and β-Gly & ELC medium,α-MEM plus β-Gly plus ELC. Specimens were analyzed by histological and histochemical methods, including immunohistochemistry for alkaline phosphatase (ALPase) activity and bromodeoxyuridine (BrdU) incorporation. Von Kossa staining revealed that the ELC medium inducedeffective calcification similar to β-Gly medium, while BrdU incorporation showed that there was no significant difference in the rates of cell proliferation between Control medium and ELC medium. Histochemical and immunofluorescence staining indicated that ALPase was activated prior to matrix calcification in cell and organ cultures. β-Gly & ELC medium induced synergistically the highest level of matrix calcification and ALPase activity. The present results suggest the possibility that ELC accelerates activity of ALPase in Meckel\u27s chondrocytes and subsequently induces matrix calcification

エナメル質の横紋形成メカニズムの解明

エナメル質の基本構造をなすエナメル小柱には横紋が観察される.この横紋は概日リズムを刻んだ成長線のひとつとして知られているが,形成メカニズムについては様々な説がある.非脱灰凍結切片で基質形成期のエナメル基質を抗アメロゲニン抗体で免疫染色すると横紋様パターンを示した.この結果から,横紋は基質形成期のアメロゲニンのタンパク量に依存した石灰化パターンであり,アメロゲニンの発現は概日的に変動するのではないかと推測した.そこで,アメロゲニンの発現に周期があるか観察するために,アメロゲニンプロモーターの下流にルシフェラーゼを繋いだコンストラクト(pGL3-1730-luc)をラットエナメル芽細胞株HAT7に遺伝子導入してアメロゲニンの転写活性を計測したところ,一定の周期をもって変動することが認められた.次に,プロモーター領域のDeletion-mutant (pGL3-464, -74, -48-luc)を作製して周期性の制御に関わる領域を検索した結果, C/EBPαのbindingモチーフが有力な候補と考えられた.その転写はMsx2によって制御を受けることが知られていることから, Msx2の発現ベクターを用いた強制発現の影響を調べたところ,そのリズムが消失した.またMsx2の遺伝子欠損マウスには基質形成の横紋様パターンが見られなかった.以上の結果から, Msx2がアメロゲニンの発現周期に影響していることが推測され,さらにアメロゲニンの発現量の周期的変化によって生じた基質形成パターンが,横紋形成に関与していると考えられた.In enamel rods, periodic bands referred to as \u27cross-striations\u27 are observed, and known as incremental lines of circadian rhythm. Though it is considered that the cross-striation is involved in the biological circadian rhythm during the secretion of enamel matrix protein by ameloblasts, the developmental mechanism involved has not been examined in detail. By immunostaining amelogenin in fresh frozen sections of mouse lower incisor, we could observe fluorescent periodic bands in the enamel matrix, which were identical to the pattern of these cross-striations. Accordingly, we focused on the biological rhythm in the section of amelogenin. We examined amelogenin mRNA transcriptional activity in an ameloblast cell line (HAT7) by using real-time luminescence microscopy. The results showed that amelogenin mRNA transcriptional activity exhibited periodic rhythmicity and that Msx2 over-expression led to the disappearance of the periodic change. Further, in the lower incisors of Msx2-deficient mice, the periodic bands were not observed. Taken together, our findings suggest that the formation of cross-striations in the enamel rods was associated with the expression of amelogenin regulated by the transcriptional activity

Dentinogenesis in the incisor teeth of adult rats after persisting daily overdosage of 1α-hydroxyvitamin D3,with special reference to osteodentin formation

雄ラット20匹を4群に分け,1群は対照群とし,実験群に0.1, 0.5, 2.5 μg/kgの1 α-OH-D3を30日間連続経口投与した.上顎切歯を材料とし,ビタミンD3の象牙質形成に及ぼす影響,特にOsteodentin形成を光顕と電顕で観察した.1)ビタミンD3低投与群では変化はみず,高投与群で著明な形態的変化を認めた.2)象牙質と象牙芽細胞の配列の乱れは最初に基底側1/3にみ,切端に向い周期的に生じる.3)象牙質と象牙芽細胞の配列が乱れる部位では,象牙前質が消失し,退行性の象牙芽細胞が多数出現し一部は不規則な象牙質中に埋入される.4)象牙芽細胞の配列が乱れる部位では象牙芽細胞直下の歯髄側に前象牙質様の構造物が出現し,これはコラーゲン基質から成る.5)上記の前象牙質様構造物に接する象牙芽細胞の近位端には象牙芽細胞の突起が出現し,基質小胞様の構造物が出現する.以上はビタミンD3の過剰投与により,周期的に象牙芽細胞に退行性変化が生じ象牙芽細胞は自ら分泌した基質中に埋入しOsteodentinを形成する可能性を示唆した雄ラット20匹を4群に分け,1群は対照群とし,実験群に0.1, 0.5, 2.5 μg/kgの1 α-OH-D3を30日間連続経口投与した.上顎切歯を材料とし,ビタミンD3の象牙質形成に及ぼす影響,特にOsteodentin形成を光顕と電顕で観察した.1)ビタミンD3低投与群では変化はみず,高投与群で著明な形態的変化を認めた.2)象牙質と象牙芽細胞の配列の乱れは最初に基底側1/3にみ,切端に向い周期的に生じる.3)象牙質と象牙芽細胞の配列が乱れる部位では,象牙前質が消失し,退行性の象牙芽細胞が多数出現し一部は不規則な象牙質中に埋入される.4)象牙芽細胞の配列が乱れる部位では象牙芽細胞直下の歯髄側に前象牙質様の構造物が出現し,これはコラーゲン基質から成る.5)上記の前象牙質様構造物に接する象牙芽細胞の近位端には象牙芽細胞の突起が出現し,基質小胞様の構造物が出現する.以上はビタミンD3の過剰投与により,周期的に象牙芽細胞に退行性変化が生じ象牙芽細胞は自ら分泌した基質中に埋入しOsteodentinを形成する可能性を示唆し