脂質二重膜中に埋め込まれた蛋白質1分子のエバネッセント場照明によるイメージング

金沢大学理工研究域近接場照明を使って、タンパク質1分子の酵素反応を可視化し、それに共役しておこる物理反応(回転、滑り運動)を同時にイメージングすることを目的にして研究を遂行した。近接場照明を生体試料の蛍光観察に応用するときには、試料のガラス表面への固定が問題となってくる。生きたままの試料を観察するために必要な条件として蛋白質分子への影響が少ないことがあげられる。また、強固に結合していることや、取り扱いやすいことなども重要な点である。本年度は、これらの条件を満たす方法としてHis-Tagを用いた蛋白質分子のガラス表面への固定方法を試みた。ガラス表面にNi-NTAを結合させるために、ガラス表面にSH基を導入したあと、アミノ基の結合したNTA(AB-NTA、同仁)を結合させた。ATP加水分解酵素F1をHis-Tagを使用してガラス表面に固定し、その回転運動を観察した。大腸菌F1のaサブユニットに遺伝子工学の手法を用いてHis-Tagを導入した。gサブユニットに導入したシステインはビオチン化の後、ストレプトアビジンを介してビオチン化蛍光標識アクチンフィラメントと結合させた。スペーサーとなる蛋白質を介さずに、直接Ni-NTAをガラス表面に結合させても、F1の活性は失われていなかったことを示す。また、回転速度のアクチンフィラメント長さ依存性を計測し、F1の回転トルクを計測したところ、いままで報告されている値とほぼ同様な値が得られた。研究課題/領域番号:10135208, 研究期間(年度):1998出典：「脂質二重膜中に埋め込まれた蛋白質1分子のエバネッセント場照明によるイメージング」研究成果報告書　課題番号10135208（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-10135208/)を加工して作

膜タンパク質分子機械の機能発現の場としてのリポソーム実験系開発

金沢大学理工研究域本研究では、生体膜を細胞の情報や物質伝達の場としてとらえる。そこで生命現象に関与する様々な化学物質やタンパク質分子の膜間移動を、生きたままの状態でリアルタイムに1分子レベルで画像化する事を目的とする。リポソーム上での1分子可視化系を確立した後、膜に埋め込んだ輸送タンパク質を通る被輸送物質を可視化する。1分子の可視化は、今まで、ガラス基板表面などの完全に人工的な表面で行われてきた。リポソーム上でタンパク質または基質となる物質の1分子観察を実現することにより、生体のメカニズムの再構築と解析に有利なツールを提供する。平成15年度までに、レーザートラップを組み込んだ倒立顕微鏡を構築した。この顕微鏡では直径数μm程度のポリスチレンラテックスビーズをレーザーの焦点に捕捉し、焦点を走査することで捕捉したポリスチレンラテックスビーズを操作することが可能である。平成16年度は、構築したレーザートラップ顕微鏡を用いて直径5μm程度のリポソームの捕捉および操作が可能であるか検討を行った。検討の結果、脂質二重膜に加わるレーザートラップの捕捉力は非常に弱いということがわかった。原因は、脂質二重膜と溶媒の屈折率の違いが小さいため、レーザートラップから受ける力が弱いためであった。これを改善し、10μm程度のジャイアントリポソームを捕捉・操作できるような系を現在開発中である。脂質二重膜内部に、捕捉操作が可能であることがわかっている屈折率の大きいポリスチレンラテックスビーズを埋め込む。このビーズをレーザートラップで捕捉・操作することにより、その周りに存在する脂質二重膜を間接的に操作する。この方法が実現可能かどうか現在検討中である。研究課題/領域番号:15710085, 研究期間(年度):2003 – 2004出典：「膜タンパク質分子機械の機能発現の場としてのリポソーム実験系開発」研究成果報告書　課題番号15710085（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-15710085/)を加工して作

脂質二重膜中の埋め込まれた蛋白質1分子のエバネッセント場照明によるイメージング

金沢大学理工研究域本研究では、ATPの化学エネルギーを回転運動という力学エネルギーに変換しているATP合成酵素F1を研究対象としている。蛍光性ATPアナログCy3-ATPを使った1分子化学反応と、蛍光標識アクチンフィラメントを指標としたF1の回転運動を同時に観察することで、膜蛋白質F1の化学力学反応の詳細な機能解析を目標とした。脂質二重膜に埋め込まれた蛋白質1分子を観察するために対物レンズ型のエバネッセント場照明顕微鏡を構築した。化学反応を可視化するためのCy3と回転運動を観察するためのBODIPY F1の両方の蛍光色素を同時観察できる顕微鏡にした。F1の回転観察では、ガラス表面に対するF1の固定方法を改良した。F1にはHis-Tagを遺伝子工学の手法で導入してある。従来、ガラス表面に非特異的に吸着させたNiNTA-ペロオキシターゼにHis-F1を吸着させていたが、本研究ではNiNTAをBSAに結合させ、NiNTA-BSAをガラス表面に吸着させることでF1をガラス表面に固定した。この方法でも従来の方法と同様にF1の回転運動が観察され、F1が発生するトルクの大きさも同様であった。次にNiNTA-BSAを介してガラス表面に固定したF1によるCy3-ATP1分子加水分解反応の画像化を行った。F1の存在する場所ではCy3-ATPの蛍光による輝点の点滅が観察された。これは、Cy3-ATPがF1に結合、F1により加水分解された後、Cy3-ADPとしてF1から解離していくことを意味している。本年度までの研究でF1の回転運動とATP加水分解反応を1分子レベルで観察する環境が整った。今後は、両者を同時に観察することにより化学力学反応のカップリングを詳細に検討する。さらにF1を脂質二重膜に埋め込み同様の解析を行う。研究課題/領域番号:11122206, 研究期間(年度):1999出典：「脂質二重膜中の埋め込まれた蛋白質1分子のエバネッセント場照明によるイメージング」研究成果報告書　課題番号11122206（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-11122206/)を加工して作

AFMを使った運動タンパク質ミオシンのATP依存性構造変化解析

金沢大学理工研究域モータータンパク質ミオシンの化学・力学エネルギー変換メカニズムを解明するため、化学反応(ATP加水分解反応)に共役した構造変化をミオシン1分子で同時に計測することを目的として研究を行った。対物レンズ型のエバネッセント場照明顕微鏡を構築した。蛍光性ATPアナログCy3-ATPを使った化学反応を可視化するため、また、Cy3で標識してミオシン1分子を可視化するために励起には半導体レーザー励起のNb:YAGレーザーを使用した。同じレーザーで蛍光色素BODIPYFLで標識したアクチンフィラメントも観察する。Cy3とBODIPY FLの蛍光はダイクロイックミラーで分離し同じ観察が可能な光学系とした。この顕微鏡を使うことによりCy3-ATPを使った1分子ATP加水分解反応の可視化が可能となった。その確認のため、ミオシンと同じモーター蛋白質分子であるATP合成酵素F1による1分子ATP加水分解反応可視化を行った。ミオシン分子をガラス表面に固定する方法の改良を行った。ミオシンの化学反応と力学反応を同時に観察するためにはミオシンの活性を失わずにガラス表面に固定しなければならない。従来は洗浄のみのガラス表面か、化学的に疎水処理されたガラス表面にミオシン分子を固定していたので、活性が失われる場合が多かった。これはガラス表面と蛋白質分子が直接相互作用することによる。そこで、本研究ではガラス表面にアガロースをスピンコートし、その表面に蛋白質分子を固定とした。この固定方法では蛋白質分子の活性は保たれたままであった。蛋白質1分子とアクチンフィラメントを同時に観察する光学系が構築でき、蛋白質分子をガラス基板に固定する方法も開発することができた。この技術とAFMを組み合わせ、今後は化学反応中の構造変化を計測していく。研究課題/領域番号:10780405, 研究期間(年度):1998 – 1999出典：「AFMを使った運動タンパク質ミオシンのATP依存性構造変化解析」研究成果報告書　課題番号10780405（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-10780405/)を加工して作

生体分子モーターF1におけるATPase反応と力学反応の同時計測

金沢大学理工研究域モータータンパク質分子であるATP合成酵素F1の動作メカニズムを解明するために、ATP加水分解反応と回転運動を1分子レベルで同時観察する事を試みた。現在所有するエバネッセント場照明蛍光顕微鏡では、蛍光色素1分子の水溶液中、実時間観察が可能である。蛍光性ATPアナログ、Cy3-ATPを使うことにより、カバーガラス表面上に固定した1分子のF1によるATP加水分解反応を観察した。ガラス表面上に輝点として観察されるCy3-ATPの密度はガラス表面に固定したF1の濃度に比例した。また、Cy3-ATPの結合解離の時定数を調べてみると、溶液中の計測から報告されている時定数と良い一致を示した。以上の二つの点は、ATP合成酵素F1による1分子化学反応が可視化されたことを示している。遺伝子工学の手法で作成した大腸菌のF1を使って、F1の回転運動観察実験を行った。F1中央のγサブユニットにストレプトアビジンを介して蛍光標識したアクチンフィラメントを結合させた。溶液中にATPを入れることにより、アクチンフィラメントの回転を観察した。ATP加水分解に伴うエネルギーを考える上では、分解産物であるADPとリン酸の濃度が大きく影響する。F1のATP加水分解反応を計測する際、溶液中のADP及びリン酸の濃度を変えてATP加水分解反応速度を計測し、ADP及びリン酸による阻害の効果について情報を得た。次年度以降は、ATP加水分解反応観察系、回転運動観察系で得られる同時観察データと、本年度に得られた生化学的なデータを組み合わせ、化学反応と力学反応の同時観察に迫り、F1の物理化学的な特性に迫りたい。研究課題/領域番号:12780490, 研究期間(年度):2000-2001出典：「生体分子モーターF1におけるATPase反応と力学反応の同時計測」研究成果報告書　課題番号 12780490（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-12780490/)を加工して作