トランスグルタミナーゼの神経系における役割りについて: 神経再生の分子機序解明

金魚の視神経は哺乳類と異なり再生し、4〜6ヵ月で視覚機能も完全に回復する。この長い再生過程(4〜6ヵ月)で働く分子を同定しその機能を追求することはきわめて重要である。本研究では特に視神経切断後早期に切断端からの再生神経線維の伸長に働く分子の同定を目指した。視神経切断後5日目の網膜からmRNAを抽出しcDNAを合成しcDNAライブラリーを作製した。ディファレンシャルハイブリ法で対照(無処置)と比べて視神経切断5日目に発現が増加(upregulation)するcDNAクローンをスクリーニングした。そのクローンの塩基配列を決定しDNA data baseの検索から、トランスグルタミネース(TG)やNa, K-ATPase α 3サブユニットをコードする遺伝子が捕捉された。ISH法や免疫組織化学法によりTGやNa, K-ATPase α 3の視神経切断後の経時変化を調べた所、網膜神経節細胞にのみ切断早期に発現が上昇し、Na, K-ATPase α 3は10日目、TGは20日でピークとなりその後徐々に対照群のそれに復した。また、成熟金魚の視神経をあらかじめ切っておき(5〜7日前)、網膜片を作製し培養すると神経節細胞から神経突起が伸長(神経再生のin vitro系の確立)する。この培養系にTG抗体やNa, K-ATPase α 3の特異的阻害剤ウアバインを添加すると、神経突起の伸長が完全に抑えられた。このことからTGやNa, K-ATPase α 3は視神経再生初期の再生線維の伸長に重要な役割を果たしていることがわかる。今後この遺伝子クローニング法を駆使して再生各時期に働く遺伝子を見つけたいと思っている。また、遺伝子改変動物を作製し、その遺伝子の機能も明らかにしたい。The goldfish optic nerve can regenerate after injury. Regrowth of optic nerve fibers starts to extend 7-10 days after optic nerve transection. They arrive at the optic tectum 3-5 weeks after axtfomy. Finally, visual function is restored 4-6 months after optic nerve transection. To understand the molecular mechanism of optic nerve regeneration, we identified genes whose expression is specifically upregulated during the early stage of optic nerve regeneration. A cDNA library constructed from goldfish retina 5 days after transection was screened Two clones were identified as the Na, K-ATPase catalytic subunitalpha 3 isoform and the neural type of transglutaminase (TG) by sequence analysis. In northern hybridization, the expression level of the both mRNAs was significantly increased at 2 days and peaked at 5-10 days, and then gradually decreased and returned to control level by 45-60 days after optic nerve transection. In situ hybridization have revealed the location of this transient retinal change after axotomy. The increased expression was observed only in the ganglion cell layer at 10-20 days after optic nerve transection, The cDNA of TG was inserted into the plasmid DNA and thus a fused protein of TG (ca. 70kDa) was obtained. Antiserum against the recombinant TG was made by immunization. Immunohistochemical staining further confirmed the data of in situ hybridization. In an explant culture system, neurite outgrowth fkm the retina 7 days after optic nerve transection was spontaneously promoted. A low concentration of ouabain (an inhibitor of Na,K ATPase alpha 3 subunit) or neutral antibody against TG, completely blocked the spontaneous neurite outgrowth from the lesioned retina. Together, these data indicate that upregulation of the Na, K-ATPase alpha 3 subunit or TG is involved in the regrowth of ganglion cell axons after axotomy. Such molecular techniques will become useful tool for future genetic studies of nerve regeneration.研究課題/領域番号:12680750, 研究期間(年度):2000–2001出典：「トランスグルタミナーゼの神経系における役割りについて: 神経再生の分子機序解明」研究成果報告書　課題番号12680750 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）)　　　本文データは著者版報告書より作

初期発生における網膜アマクリン細胞層形成の分子的機序の解明

金沢大学医学部研究課題/領域番号60770056, 研究期間(年度):1985出典：研究課題「初期発生における網膜アマクリン細胞層形成の分子的機序の解明」課題番号60770056（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-60770056/）を加工して作

Neuroprotective effects of 5-S-GAD against oxidative stress-induced apoptosis in RGC-5 cell.

金沢大学医薬保健研究域　医学系N-β-Alanyl-5-S-glutathionyl-3,4-dihydroxyphenylalanine (5-S-GAD), an antibacterial substance isolated from the flesh fly, has been described as having multipotential biological activities toward various tissues. In a previous paper, we reported a novel neuroprotective action of 5-S-GAD on rat retinal ganglion cell apoptosis induced by optic nerve injury and intraocular N-methyl-d-aspartate treatment in vivo. In the present study, we further investigated the protective mechanism of this small peptide against other types of apoptosis in cultured cells of the established rat retinal ganglion cell line RGC-5. Hydrogen peroxide and serum deprivation treatments induced intracellular reactive oxygen species levels and lipid peroxidation, revealed by 4-hydroxy-2-nonenal production, in RGC-5 cells within 9-12 h. The treatments also induced cell death accompanied by nuclear condensation, DNA laddering and increases in apoptotic Bax and caspase-3 proteins in RGC-5 cells within 12-24 h. 5-S-GAD at 25-50 μM clearly suppressed the cell death and apoptotic features induced by these treatments. 5-S-GAD restored the nuclear condensation, DNA laddering and increases in apoptotic proteins. Furthermore, 5-S-GAD directly activated anti-apoptotic phospho-Akt and Bcl-2 proteins in RGC-5 cells. 5-S-GAD also quenched the reactive oxygen species production and inhibited the lipid peroxidation induced by oxidative stress. Therefore, 5-S-GAD may complementarily protect RGC-5 cells against apoptosis through dual actions as a radical scavenger and an inducer of anti-apoptotic phospho-Akt and Bcl-2. Taken together, 5-S-GAD is a high-potential tool for rescuing the retinal ganglion cell apoptosis induced by a variety of glaucomatous conditions. Crown Copyright © 2009

視神経再生中に見られる山中因子の活性化機構と神経再生における役割について

哺乳類と異なり魚の視神経は損傷を受けても再生する。なぜ再生できるのかを考えたとき、我々は視神経損傷により網膜神経節細胞(RGCs)が幼若化するのではないかと考え、神経幹細胞のマーカーや山中因子について検討したところ、山中因子のsox2, klf4, c-myc が損傷2-3日で、RGCsで活性化し、その後幹細胞マーカー、ネスチンも活性化することを見出した。このシグナルカスケードについて検討したところ、LIF(リューケミア インヒビトリー ファクター)が1～2日と最も早期に活性化することを見つけ、LIF以降のカスケードについて現在検討中である。Unlike mammals, fish optic nerve can regenerate after nerve injury. We have a hypothesis of this regenerative capacity of fish optic nerve that mature retinal ganglion cells (RGCs) in fish are reprogrammed to neural stem-cell like cells by optic nerve injury. To certain this hypothesis, we investigated expression levels of sox2, klf4, c-myc and nestin in the zebrafish retina after optic nerve injury. The levels of sox2, klf4 and c-myc mRNA increased in the retina 3 days after axotomy. The level of a neural stem cell marker, nestin increased in the retina 4-5 days after axotomy. These molecules were all localized to the RGCs. Furthermore, we found that leukemia inhibitory factor (LIF) was positional as an upstream signal to the klf4 and sox2. In the presence of LIF in culture medium of retinal explant, a significant neurite outgrowth could be seen as compared to the no treatment, control. In contrast, the inhibition of LIF signals leaded to the suppression of neurite outgrowth from retina. Therefore, we conclude that the capability of fish optic nerve regeneration is due to reprograming mechanism of matured RGCs after optic nerve injury.研究課題/領域番号:23650163, 研究期間(年度):2011-201

脊髄損傷後の感覚神経線維再生促進の新しい試み

金沢大学健康増進科学センター脊髄損傷後の運動神経ニューロン、感覚神経ニューロンの生死、再生について調べることを目的とし、ゼブラフィッシュの脊髄切断モデルを作製し、経過観察を行った。まず運動神経系に関しては、脳内の上位運動神経は損傷後も生存し、2－3ヵ月で再生軸索を下位脊髄に伸長することが分かった。また、下位脊髄内の運動神経は、中心管近くの上衣細胞から分化されることが分かった。その際、Sox2の発現が早期に上昇することが証明された。感覚神経系については切断後6週までの観察であるが、死滅せず生存することは判明したが、軸索が上位脊髄を再伸長する証拠は得られなかった。In the transectioned zebrafish spinal cord model, upper motor neurons in the brain can survive and regrow their axon after spinal cord injury. The regenerative axons from upper motor neurons in the brain were accompanied with upregulation of IGF-1 expression in their soma. While lower appeared to be neurons were newly synthesized from ependymal cells nearly located near in the central canal of the spinal cord. Sensory neuron in the dorsal root ganglion can survive but not regrow their axons after spinal cord injury.研究課題/領域番号:25640008, 研究期間(年度):2013-04-01 – 2015-03-3

ChIP-on-chip 法による再生初期遺伝子群の同定とラット視神経再生への応用

中枢神経の再生可能なサカナの視神経切断モデルを使用し、再生初期に発現が上昇する遺伝子を同定し、細胞生存や神経突起伸長作用を確認し、これらを神経再生初期分子とした。この候補物質としてHSP70, レチノール結合蛋白プルプリンを同定した。これらに引き続いてレチノイン酸シグナル分子の発現が上昇した。これら再生分子を成熟ラット網膜に導入することにより、ラット視神経がin vivoで再生できた。Regeneration-associated genes (RAGs) were cloned from axotomized zebrafish retina. HSP70 (a stress protein) and purpurin (a retinol-binding protein) were rapidly induced in the fish retina after optic nerve injury. HSP70 was involved in cell survival of injured retinal ganglion cells (RGCs), whereas purpurin was involved in neurite sprouting from injured RGCs. These RAGs could easily induce regrowth of axotomized optic nerve in adult rat