Kinetische Untersuchungen zum Zusammenhang von Sequenz, Struktur und Funktion der Hammerhead Ribozyme

Das Hammerhead Ribozym (HHRz) ist die kleinste bekannte katalytische RNA und katalysiert die Spaltung und Ligation des eigenen Phosphordiesterrückgrads durch eine Umesterungsreaktion (SN2-Reaktion; Lilley, 2003). Die Minimalstruktur der HHRz besteht aus einer hochkonservierten katalytischen Core-Region und drei flankierenden Helices mit variablen Längen. Natürlich vorkommende HHRz werden anhand der Helix die nicht durch einen Hairpin Loop geschlossen ist, in drei verschiedene Typen eingeteilt. Die katalytische Aktivität der HHRz ist abhängig von verschiedenen Faktoren, zum einen vom Vorhandensein von divalenten Metall-Ionen und zum anderen von Tertiärinteraktionen zwischen den Loops1 und 2 bzw. den Helices I und II. Basierend auf der Tatsache, dass Interaktionen zwischen den Loops1 und 2 bzw. zwischen den Helices I und II für eine effiziente Faltung und schnelle Spaltungskinetiken verantwortlich sind, könnten für die HHRz kombinierte Sequenz- und Strukturbeschreibungen erstellt werden. Mit diesen ist es möglich gezielt Datenbanken nach genomisch codierten HHRz zu durchsuchen. So konnten in Zusammenarbeit mit Carsten Seehafer und dem von ihm entwickelten Programm RNAhit, welches auf Sequenz- und Strukturmotiven sowie auf thermodynamischen Faltungsparametern basiert, eine Vielzahl von Typ III HHRz in allen Bereichen des Lebens identifiziert werden. Jedoch kann durch diese Suchen nicht zwischen HHRz unterschieden werden, die nur den Musterbeschreibungen entsprechen und solchen die katalytisch funktionell sind. Somit sollte anhand von 19 ausgewählten primären HHRz Treffern, aus Xenopus tropicalis, Arabidopsis thaliana und Arabidopsis lyrata, die katalytische Aktivität in in vitro Spaltungsexperimenten untersucht und anhand der Ergebnisse die Filtereinstellungen bestätigt oder optimiert werden. Der ∆G-Wert ist ein Maß für die thermodynamische Stabilität einer Molekülstruktur und somit, neben der freien Faltung in ein HHRz, eines der wichtigsten Filterkriterien bei der Suche nach katalytisch aktiven HHRz. Alle ausgewählten primären Treffer zeigten einen ∆G0 37°C, free-Wert von ≤ -10 kcal/mol und unterschiedliche ∆∆G0-Werten. In in vitro Spaltungsanalysen in Anwesenheit von 2 mM MgCl2 konnten für acht der insgesamt 19 analysierten HHRz in Abhängigkeit von der Zeit eine autokatalytische Aktivität beobachtet werden. Dabei zeigten die HHRz Motive Xetr1, 2, 4, 5, 7 und 8 aus X. tropicalis, Arly3 aus A. lyrata und das als Positivkontrolle eingesetzte Ara1 Motiv die Spaltung des full length Transkripts in die beiden Spaltprodukte. In einem anschließenden Vergleich der Sequenzen, Sekundärstrukturen und thermodynamischen Parameter der spaltenden und nicht spaltenden HHRz, konnten die Filtereinstellungen zur Identifizierung katalytisch aktiver HHRz wie folgt angepasst werden: Der ∆∆G0-Wert sollte 0 sein, die freie Faltung sollte die typische HHRz Sekundärstruktur ausbilden und die Helix-Regionen I und II sollten keine Wobble-Basenpaarung (U-G oder G-U) aufweisen. Nach Anwendung des angepassten Analyseprogramms konnten für A. thaliana aus den anfänglich 988 Treffern lediglich die beiden schon bekannten katalytisch aktiven HHRz, Ara1 und Ara2, gefunden werden. Im Falle von A. lyrata konnte unter den 1490 gefundenen HHRz Motiven ein Treffer, mit einer Sequenzhomologie von 99% zu Ara1 aus A. thaliana, identifiziert werden und für X. tropicalis konnten aus der Großzahl der primären Treffer (4976) noch 6 katalytisch aktive HHRz herausgefiltert werden. Somit stellt sich heraus, dass nicht jedes den Musterbeschreibungen entsprechende HHRz Motiv katalytische Eigenschaften besitzt und dass es einer spezifischen Filtereinstellung zur Identifizierung von aktiven HHRz bedarf. Des Weiteren konnten die 6 neu identifizierten HHRz aus X. tropicalis auf genomischer DNA amplifiziert werden, wobei nicht für alle Motive eine 100%ige Übereinstimmung zu den in der Datenbank hinterlegten Sequenzen festgestellt werden konnte. Lediglich die beiden hochkonservierten Motive Xetr7 und 8 zeigten eine 100%ige Homologie und wurden in Abhängigkeit ihrer genomischen Umgebungssequenz in vitro auf ihre katalytische Aktivität geprüft. Dabei konnte entgegen aller Erwartungen festgestellt werden, dass in der Umgebungssequenz von Xetr7 und 8 zusätzliche katalytisch aktive HHRz vorhanden sind, die mit den zuvor beschriebenen Analyseprogramm RNAhit nicht gefunden werden konnten. Weiterhin konnte mittels einem S1 Nuklease Protektionassay die Expression dieser hochkonservierten Region in verschiedenen Geweben von X. tropicalis gezeigt werden. Die Ausbildung der katalytisch aktiven Form eines HHRz beruht auf tertiären Interaktionen zwischen den Loops1 und 2 und es spielen die hochkonservierten Nukleotide der Core-Region eine entscheidende Rolle. So konnte in diesem Zusammenhang bereits in zahlreichen Studien gezeigt werden, dass diese tertiären Interaktionen die Aktivität natürlich vorkommender HHRz erhöhen und die Abhängigkeit der Magnesiumkonzentrationen auf einen in der Zelle vorhandenen physiologischen Wert senken. In diesem Zusammenhang konnten, neben den in vitro Spaltungsanalysen erstmals auch ein von Stephan Wiegand in Dictyostelium discoideum etabliertes ß-Gal Reportersystem zur in vivo Analyse der katalytischen Aktivität der HHRz Motive unter physiologischen Bedingungen genutzt werden. Somit wurden PolyC-Loop Mutanten von vier unterschiedlichen Typ III HHRz Wildtypsequenzen (Xetr2 und 5, PLMVd, Ara1) in vivo und in vitro analysiert. Dabei stellte sich heraus, dass die Ausbildung von tertiären Interaktionen zwischen den Loops1 und 2 über nicht Watson-Crick Basenpaare in den verschiedenen Organismen nicht denselben Einfluss auf die katalytische Aktivität haben. So wiesen alle PolyC-Loop1 Mutanten eine ähnliche Aktivität wie der WT auf, wogegen die PolyC-Loop2 Mutanten eine deutlich verringerte Aktivität zeigten. Dies deutet darauf hin, dass die Substitution der Loop2 Nukleotide zu Cytosinen die Interaktion mit Loop1 verringert, wodurch den WT Nukleotiden in Loop2 eine für die katalytische Aktivität entscheidende Rolle zukommt. Lediglich bei den PLMVd C-Loop Mutanten konnte im Spaltungsverhalten kein nennenswerter Unterschied im Vergleich zum WT festgestellt werden. Somit sprechen die Ergebnisse deutlich für die Ausbildung von individuellen tertiären Interaktionen zwischen den Loop1 und Loop2 Sequenzen bzw. den Helices I und II, wodurch die aktive Konformation des HHRz stabilisiert wird. Des Weiteren zeigt die Core-Region der HHRz eine hochkonservierte Sequenz bestehend aus 11 Nukleotiden, dabei ist die Spaltstelle so definiert, dass an Position 17 ein A, C oder U aber kein G vorhanden sein sollte. Im Falle eines G an dieser Position sollte es zu einer Basenpaarung mit dem gegenüberliegenden C an Position 3 kommen, somit sollte die Spaltstelle blockiert werden und keine aktive HHRz Konformation ausgebildet werden (Ruffner et al., 1990). Unter dieser Voraussetzung sollte die G17 Mutante zunächst als interner Größenstandard für das WT Motiv in der in vitro Transkription dienen. Jedoch zeigten diese in vitro Experimente eine katalytische Aktivtiät der G17 Mutanten, welche anschließend auch unter physiologischen Bedingungen in in vitro und in vivo Experimenten bestätigt werden konnten. Auffällig war, dass sie deutlich geringere Spaltungseffizienzen als die WT Sequenzen hatten, was mit der Ausbildung des G17C3 Basenpaares zusammenhängen könnte und dessen Einfluss auf die Bildung des für die katalytische Aktivität erforderlichen C3G8 Basenpaares. Anhand der erhaltenen Ergebnisse für die Funktionalität der G17 Mutante konnten diese Varianten auch im Genom von X. tropicalis, A. thaliana und S. mansoni identifiziert werden. Dabei zeigte sich, dass diese Motivvariationen der HHRz ähnlich häufig in den verschiedensten Organismen zu finden waren wie die C17 Motive und mit ihrer verringerten katalytischen Aktivität eine besondere Rolle in der Zelle spielen könnten. Mittels der Datenbanksuchen und experimentellen Analysen konnte ein Einblick über die Variabilität und Verbreitung der HHRz erhalten werden, wodurch jedoch die Suche nach der biologischen Funktion der HHRz in der Zelle deutlich erschwert wird

From alpaca to zebrafish: Hammerhead ribozymes wherever you look

The hammerhead ribozyme was originally discovered in subviral plant pathogens and was subsequently also found in a few other genomic locations. Using a secondary structure–based descriptor, we have searched publicly accessible sequence databases for new examples of type III hammerhead ribozymes. The more than 60,000 entries fulfilling the descriptor were filtered with respect to folding and stability parameters that were experimentally validated. This resulted in a set of 284 unique motifs, of which 124 represent database entries of known hammerhead ribozymes from subviral plant pathogens and A. thaliana. The remainder are 160 novel ribozyme candidates in 50 different eukaryotic genomes. With a few exceptions, the ribozymes were found either in repetitive DNA sequences or in introns of protein coding genes. Our data, which is complementary to a study by De la Peña and García-Robles in 2010, indicate that the hammerhead is the most abundant small endonucleolytic ribozyme, which, in view of no sequence conservation beyond the essential nucleotides, likely has evolved independently in different organisms

Characterization of hammerhead ribozyme reactions

Hammerhead ribozymes are small catalytic RNA motifs ubiquitously present in a large variety of genomes. The reactions catalyzed by these motifs are both their self-scission and the reverse ligation reaction. Here, we describe methods for the generation of DNA templates for the subsequent in vitro transcription of hammerhead ribozymes. This is followed by a description of the preparation of suitable RNA molecules for both reaction types, and their kinetic analysis

Multiplicity dependence of light (anti-)nuclei production in p–Pb collisions at sNN=5.02 TeV

The measurement of the deuteron and anti-deuteron production in the rapidity range −1 < y < 0 as a function of transverse momentum and event multiplicity in p–Pb collisions at √sNN = 5.02 TeV is presented. (Anti-)deuterons are identified via their specific energy loss dE/dx and via their time-of- flight. Their production in p–Pb collisions is compared to pp and Pb–Pb collisions and is discussed within the context of thermal and coalescence models. The ratio of integrated yields of deuterons to protons (d/p) shows a significant increase as a function of the charged-particle multiplicity of the event starting from values similar to those observed in pp collisions at low multiplicities and approaching those observed in Pb–Pb collisions at high multiplicities. The mean transverse particle momenta are extracted from the deuteron spectra and the values are similar to those obtained for p and particles. Thus, deuteron spectra do not follow mass ordering. This behaviour is in contrast to the trend observed for non-composite particles in p–Pb collisions. In addition, the production of the rare 3He and 3He nuclei has been studied. The spectrum corresponding to all non-single diffractive p-Pb collisions is obtained in the rapidity window −1 < y < 0 and the pT-integrated yield dN/dy is extracted. It is found that the yields of protons, deuterons, and 3He, normalised by the spin degeneracy factor, follow an exponential decrease with mass number

Performance of the ALICE Electromagnetic Calorimeter

International audienceThe performance of the electromagnetic calorimeter of theALICE experiment during operation in 2010–2018 at the Large HadronCollider is presented. After a short introduction into the design,readout, and trigger capabilities of the detector, the proceduresfor data taking, reconstruction, and validation are explained. Themethods used for the calibration and various derived corrections arepresented in detail. Subsequently, the capabilities of thecalorimeter to reconstruct and measure photons, light mesons,electrons and jets are discussed. The performance of thecalorimeter is illustrated mainly with data obtained with test beamsat the Proton Synchrotron and Super Proton Synchrotron or inproton-proton collisions at √s = 13 TeV, and compared tosimulations

Measurement of beauty production via non-prompt D0{\rm D}^{0} mesons in Pb-Pb collisions at sNN\sqrt{s_{\rm NN}} = 5.02 TeV

The production of non-prompt ${\rm D}^{0}$ mesons from beauty-hadron decays was measured at midrapidity ($\left| y \right| 5~\mathrm{GeV}/c$ in the $0-10$% central Pb-Pb collisions. The data are described by models that include both collisional and radiative processes in the calculation of beauty-quark energy loss in the quark-gluon plasma, and quark recombination in addition to fragmentation as a hadronization mechanism. The ratio of the non-prompt to prompt ${\rm D}^{0}$-meson $R_{\rm AA}$ is larger than unity for $p_{\rm T} > 4~\mathrm{GeV}/c$ in the $0-10$% central Pb-Pb collisions, as predicted by models in which beauty quarks lose less energy than charm quarks in the quark-gluon plasma because of their larger mass

First measurement of the absorption of 3He‾^{3}\overline{\rm He} nuclei in matter and impact on their propagation in the galaxy

Antimatter particles such as positrons and antiprotons abound in the cosmos. Much less common are light antinuclei, composed of antiprotons and antineutrons, which can be produced in our galaxy via high-energy cosmic-ray collisions with the interstellar medium or could also originate from the annihilation of the still undiscovered dark-matter particles. On Earth, the only way to produce and study antinuclei with high precision is to create them at high-energy particle accelerators like the Large Hadron Collider (LHC). Though the properties of elementary antiparticles have been studied in detail, knowledge of the interaction of light antinuclei with matter is rather limited. This work focuses on the determination of the disappearance probability of \ahe when it encounters matter particles and annihilates or disintegrates. The material of the ALICE detector at the LHC serves as a target to extract the inelastic cross section for \ahe in the momentum range of $1.17 \leq p < 10$ GeV/$c$. This inelastic cross section is measured for the first time and is used as an essential input to calculations of the transparency of our galaxy to the propagation of $^{3}\overline{\rm He}$ stemming from dark-matter decays and cosmic-ray interactions within the interstellar medium. A transparency of about 50% is estimated using the GALPROP program for a specific dark-matter profile and a standard set of propagation parameters. For cosmic-ray sources, the obtained transparency with the same propagation scheme varies with increasing $^{3}\overline{\rm He}$ momentum from 25% to 90%. The absolute uncertainties associated to the $^{3}\overline{\rm He}$ inelastic cross section measurements are of the order of 10%$-$15%. The reported results indicate that $^{3}\overline{\rm He}$ nuclei can travel long distances in the galaxy, and can be used to study cosmic-ray interactions and dark-matter decays

First study of the two-body scattering involving charm hadrons

This Letter presents the first measurement of the interaction between charm hadrons and nucleons. The two-particle momentum correlations of $\mathrm{pD^-}$ and $\mathrm{\overline{p}D}^+$ pairs are measured by the ALICE Collaboration in high-multiplicity pp collisions at $\sqrt{s} = 13~\mathrm{TeV}$. The data are compatible with the Coulomb-only interaction hypothesis within (1.1-1.5)$\sigma$. Considering an attractive nucleon(N)$\overline{\mathrm{D}}$ strong interaction, in contrast to most model predictions which suggest an overall repulsive interaction, slightly improves the level of agreement. This measurement allows for the first time an estimation of the 68% confidence level interval for the isospin $\mathrm{I}=0$ inverse scattering length of the $\mathrm{N\overline{D}}$ state ${f_{0,~\mathrm{I}=0}^{-1} \in [-0.4,0.9]~\mathrm{fm^{-1}}}$, assuming negligible interaction for the isospin $\mathrm{I}=1$ channel

Study of the p−-p−-K+^+ and p−-p−-K−^- dynamics using the femtoscopy technique

International audienceThe interactions of kaons (K) and antikaons ($\mathrm{\overline{K}}$) with few nucleons (N) were studied so far using kaonic atom data and measurements of kaon production and interaction yields in nuclei. Some details of the three-body KNN and $\mathrm{\overline{K}}$NN dynamics are still not well understood, mainly due to the overlap with multi-nucleon interactions in nuclei. An alternative method to probe the dynamics of three-body systems with kaons is to study the final state interaction within triplet of particles emitted in pp collisions at the Large Hadron Collider, which are free from effects due to the presence of bound nucleons. This Letter reports the first femtoscopic study of p$-$p$-$K$^+$ and p$-$p$-$K$^-$ correlations measured in high-multiplicity pp collisions at $\sqrt{s}$ = 13 TeV by the ALICE Collaboration. The analysis shows that the measured p$-$p$-$K$^+$ and p$-$p$-$K$^-$ correlation functions can be interpreted in terms of pairwise interactions in the triplets, indicating that the dynamics of such systems is dominated by the two-body interactions without significant contributions from three-body effects or bound states