Identifizierung von Effektoren der Pheromon-MAPK-Kaskade in Ustilago maydis

Die sexuelle Entwicklung von Ustilago maydis, dem Erreger des Maisbeulenbrandes, wird durch die Fusion zweier haploider Sporidien eingeleitet. Das aus der Zellfusion hervorgehende Dikaryon ist dann in der Lage die Maispflanze zu infizieren. Diese Entwicklungsprozesse werden durch die beiden Paarungstyploci a und b kontrolliert. Der biallelische a-Locus kodiert für ein Pheromon-Pheromonrezeptorsystem, das die Zell-Zellerkennung und die anschließende Zellfusion gewährleistet. Der multiallelische b-Locus kodiert für zwei Homeodomänenproteine, bE und bW, die nur in bestimmten Kombinationen heterodimerisieren und weitere Entwicklungsschritte ermöglichen. Während der Zell-Zellerkennung induziert das Pheromonsignal die Ausbildung von Konjugationshyphen und die Transkription der a- und b-Paarungstypgene. Die Induktion der a- und b-Gene erfolgt über den Transkriptionsfaktor Prf1, der über den cAMP-Signalweg und das Pheromon-MAPK-Modul posttranskriptionell aktiviert wird. Das aktive MAPK-Modul induziert zusätzlich die Transkription von prf1 und ist außerdem für die Ausbildung der Konjugationshyphen verantwortlich. Prf1 wird für die Konjugationshyphenbildung jedoch nicht benötigt. Diese Ergebnisse früherer Arbeiten deuteten auf die Existenz von weiteren unterhalb des MAPK-Moduls agierenden Regulatoren der Pheromonantwort hin. In dieser Arbeit wurden mit Rop1 und Hmg3 zwei HMG-Domänen-Transkriptionsfaktoren identifiziert, die wie Prf1 zur sequenzspezifisch DNA-bindenden Klasse dieser Proteinfamilie gehören. Während hmg3-Deletionsmutanten zwar einen schwachen Zellfusions- und Pathogenitätsdefekt zeigten, jedoch nach Pheromonstimulation Konjugationshyphen bildeten und lediglich eine leicht reduzierte Expression des Pheromongens aufwiesen, führte die Deletion von rop1 zum Verlust der Pheromon-induzierten Genexpression sowie der Konjugationshyphenbildung. Weitere Untersuchungen zeigten, dass rop1 selbst in Stämmen, die eine konstitutiv aktive Variante der MAPKK Fuz7 exprimieren für die Transkription von prf1 sowie die a- und b-Genexpression erforderlich ist. Dieser Ansatz ergab auch, dass rop1 an der Ausbildung von Konjugationshyphen nur indirekt beteiligt ist. Desweiteren wurden die starken Zellfusions- und Filamentationsdefekte von Drop1-Stämmen durch die konstitutive Expression von prf1 komplementiert, was darauf hindeutete, dass Rop1 einen entscheidenden Regulator der prf1-Expression darstellt. Gelretardationsexperimente ergaben dann, dass Rop1 in vitro spezifisch an den prf1-Promotor bindet und ermöglichten ferner die Identifizierung eines DNA-Bindemotivs, das sich in einer Reihe weiterer putativer Promotorregionen des U. maydis Genoms findet. In Northern-Analysen konnte gezeigt werden, dass das genetisch aktivierte MAPK-Modul die rop1-Expression über die MAPK Kpp2 induziert. Im Gegensatz dazu führte die genetische Aktivierung des cAMP-Signalweges zur Repression der rop1-Expression. Überraschenderweise exprimierten rop1-Deletionsmutanten auf der Pflanzenoberfläche ausreichend prf1, um alle Entwicklungsstadien zu durchlaufen und volle Pathogenität zu entwickeln. Dies deutet auf die Existenz von zusätzlichen Regulatoren der prf1-Expression auf der Pflanze hin

Pathogenitätsrelevante Signalkaskaden in Ustilago maydis: Identifikation von Zielgenen

In Ustilago maydis sind drei Signalwege bekannt, die für die pathogene Entwicklung dieses Brandpilzes essentiell sind. Während die Kpp4/Fuz7/Kpp2-MAPK-Kaskade und der cAMP-Weg für den Paarungsprozess und die Ausbildung von frühen Infektionsstrukturen benötigt werden, ist die Kpp6-MAPK-Kaskade entscheidend für die Penetration der Blattoberfläche. Bisher waren nur wenige Zielgene dieser Signalwege bekannt. In dieser Arbeit wurden isogene Stämme konstruiert, die eine regulierbare genetische Aktivierung der einzelnen Signalkaskaden ermöglichen. Durch genomweite Microarray-Analysen (Affymetrix)wurde das Transkriptom dieser Stämme untersucht und mit der Situation nach Pheromonstimulation verglichen. Unter den differentiell regulierten Genen konnten neben zahlreichen bekannten auch eine Vielzahl neuer Zielgene identifiziert werden. Vergleichende Analysen der Transkriptome zeigen, dass eine deutliche Überlappung der Signalwege vorliegt. An der Regulation dieses Netzwerks sind neben dem HMG-Domänen Transkriptionsfaktor Prf1 weitere Komponenten beteiligt, die vermutlich posttranskriptionell reguliert werden. Nach Aktivierung des cAMP-Wegs wurden drei koregulierte Gencluster identifiziert, die eine potentielle Funktion bei der Eisenaufnahme haben. Unter den koregulierten Genen befinden sich Vertreter des reduktiven und des nicht-reduktiven Eisenaufnahme-systems, u.a. die bereits bekannten Gene sid1 und sid2, die für eine Ornithin-5-Monooxigenase und eine Ferrichrom-Siderophoren-Peptidsynthetase kodieren. Für die Expression dieser Gene wird ein intakter cAMP-Weg benötigt, darüber hinaus werden die Gene durch Eisen reprimiert. Da bereits bekannt war, dass das nicht-reduktive Eisenaufnahmesystem keine Rolle bei der pathogenen Entwicklung von U. maydis spielt, konzentrierte sich die Arbeit auf die hochaffine Eisenpermease die Teil des reduktiven Eisenaufnahmesystems ist. Durch Komplementation einer Hefemutante konnte gezeigt werden, dass fer2 für eine funktionelle Eisenpermease kodiert. fer2-Deletionsmutanten zeigen einen Wachstumsdefekt auf Eisenmangelmedium. In der Pflanze ist die Proliferation solcher Mutanten stark reduziert und die Ausbildung von Pathogenitätssymptomen deutlich abgeschwächt. Dies zeigt, dass Komponenten des reduktiven Eisenaufnahmesystems Virulenzfaktoren in U. maydis sind

Die Rolle von RNA-bindenden Proteinen bei der pathogenen Entwicklung von Ustilago maydis

Ustilago maydis ist der Erreger des Maisbeulenbrands. Eine erfolgreiche Infektion der Maispflanze durch den phytopathogenen Basidiomyzeten ist abhängig von zahlreichen morphologischen Transitionen, wie beispielsweise die pheromoninduzierte Bildung von Konjugationshyphen, der Wechsel zum dikaryotischen Wachstum nach der Fusion zweier kompatibler Sporidien und das verzweigte Wachstum des Myzels nach dem Eindringen des Pilzes in die Wirtspflanze. Unter Verwendung einer bioinformatischen Analyse konnten im Vorfeld dieser Arbeit bereits 24 offene Leserahmen (ORF) identifiziert werden, die für potenziell RNA-bindende Proteine kodieren und den Ausgangspunkt dieser Arbeit darstellten. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von 3 PUM-, 4 KHD- und 11 RRM-Proteinen auf die Entwicklungsprogramme über einen revers-genetischen Ansatz untersucht. Durch eine extensive phänotypische Analyse konnte für die Genprodukte dreier ORFs ein Einfluss auf die Entwicklung von U. maydis festgestellt werden; die Proteine wurden mit Khd1, Khd4 bzw. Rrm4 bezeichnet. Während die Deletion von khd1 zu einem kältesensitiven Verhalten führt, hat die Deletion von khd4 Veränderungen der Sporidienmorphologie, Wachstumsrate, Pheromonantwort sowie der Pathogenität zur Folge. Die Deletion von rrm4 führt zu einem Verlust des schnellen polaren Wachstums und zu einer reduzierten Virulenz. Die Domänenarchitektur von Rrm4 zeigt Ähnlichkeiten mit Proteinen der ELAV-Familie (embryonic lethal and abnormal vision). Neben den drei für ELAV-Proteine typischen Modulen der RRM-Domäne im N-Terminus, besitzt Rrm4 eine zusätzliche C-terminale PABC-Domäne (poly[A]-binding protein C-terminal domain), die als Proteininteraktionsdomäne bekannt ist. Rrm4 akkumuliert PABC-abhängig in zytoplasmatischen Partikeln, die sich bidirektional entlang des Mikrotubulizytoskeletts bewegen. Bei der Untersuchung des Transportmechanismus konnte eine indirekte Beteiligung des konventionellen Kinesins Kin2 gezeigt werden, weshalb die Beteiligung eines weiteren Motorproteins am plusendgerichteten und des Dyneins am minusendgerichteten Partikeltransport vermutet wird. Darüber hinaus lassen Mutationsstudien an den RRM-Domänen eine Beteiligung der ersten beiden RRM-Domänen an der RNA-Bindung vermuten. Die Bedeutung von Rrm4 auf die Pathogenität von U. maydis und die Bewegung des RNA-bindenden Proteins entlang des Mikrotubulizytoskeletts deuten auf eine wichtige Funktion von RNA-Transport während der pathogenen Entwicklung von U. maydis hin

Die Auswirkung der posttranslationellen Aktivierung des Transkriptionsfaktors Prf1 auf die Pheromonantwort in Ustilago maydis

Voraussetzung für eine erfolgreiche Infektion des phytopathogenen Pilzes Ustilago maydis ist die Erkennung und Fusion zweier kompatibler Sporidien auf der Pflanzenoberfläche. Als entscheidendes Signal wirkt dabei die gegenseitige Pheromonstimulation. Diese wird in der Zelle über mindestens zwei Signalwege weitergeleitet, eine MAP-Kinase-Kaskade (MAPK) sowie eine cAMP-abhängige Proteinkinase A (PKA). Zielprotein der beiden pheromonaktivierten Kinasen ist der Transkriptionsfaktor Prf1, welcher die Expression vieler in den folgenden Entwicklungsschritten entscheidender Faktoren reguliert. In Mutationsanalysen konnte gezeigt werden, dass die entsprechenden MAPK- und PKA-Phosphorylierungsstellen in Prf1 für dessen Aktivierung von essentieller Bedeutung sind. Die beiden Kinasen beeinflussen die Funktion des Transkriptionsfaktors in unterschiedlicher Weise, wobei das Phosphorylierungsmuster auf Prf1 insbesondere eine Unterscheidung der Promotoren der Gene der beiden Kreuzungstyploci zu erlauben schien. In der vorliegenden Arbeit konnte zunächst das tetrazyklinregulierte Expressionssystem als wichtige Ergänzung des Promotorrepertoires in U. maydis etabliert werden. Die tetrazyklinvermittelte Regulation von prf1 belegte Einsatzfähigkeit und Effizienz des heterologen Systems. Erste Hinweise auf die Mechanismen, welche der pheromonvermittelten Aktivierung von Prf1 zugrunde liegen, konnten durch die Lokalisierung des Proteins sowie die Entkopplung funktioneller Module gewonnen werden. Dabei deutete sich an, dass die DNA-Bindeeigenschaften wie auch das Transaktivierungspotential von Prf1 Angriffspunkte dieser Regulation darstellen könnten. Die Charakterisierung konstitutiv aktivierter Prf1-Varianten erlaubte es, die physiologische Relevanz der PKA-Phosphorylierung zu bestätigen. AnschließendeMicroarray-Analysen ermöglichten eine transkriptomweite Untersuchung der Auswirkung von PKA- wie auch MAPK-Modifikationen. Dabei konnten innerhalb der pheromonregulierten Gene unterschiedliche Regulationsklassen definiert werden, deren Expression durch den Phosphorylierungsstatus von Prf1 bestimmt wird. Während die transkriptionelle Induktion von prf1 ausreicht, um u.a. die Expression von Faktoren der Pheromonreifung und -sekretion zu induzieren, bestimmen MAPK- oder PKA-Phosphorylierung die Regulation destinkter Gengruppen. Diese Ergebnisse unterstreichen, dass der Transkriptionsfaktor Prf1 auf posttranslationeller Ebene zu einer Veränderung der Zielpromotorspezifität in der Lage ist, welche ein neues Konzept der Vernetzung unterschiedlicher Signalwege in der pilzlichen Pheromonantwort darstellt

Structure-function analysis of Cmu1, the secreted chorismate mutase from Ustilago maydis

The basidiomycete fungus Ustilago maydis is the causative agent for smut disease of maize (Zea mays). More than 400 putative secreted proteins are encoded in the genome of U. maydis. The secreted chorismate mutase Cmu1 of U. maydis is such a translocated virulence promoting effector. The chorismate mutase activity of Cmu1 in the cytosol is proposed to lower the chorismate levels in the chloroplast where it would serve as precursor for the biosynthesis of the plant defense hormone salicylic acid (SA). The crystal structure of Cmu1 revealed several unique features in comparison to the cytoplasmic chorismate mutase Aro7p of Saccharomyces cerevisiae, including a surface exposed acidic patch, a disulfide bond, a putative fatty acid binding site and a loop region. This thesis shows, that site-directed mutagenesis affecting the acidic patch, the disulfide bond and the fatty acid binding site results in functional mutant proteins that can complement the virulence phenotype of CL13Δcmu1 strains. Wildtype Cmu1 protein purified after heterologous expression in E. coli followed a Michaelis-Menten kinetic in a chorismase mutase activity assay. Mutations in the fatty acid binding site did not alter the observed kinetic. A U. maydis triple mutant of cmu1, the isochorismatase coding gene um12021 and shy1 encoding a salicylate hydroxylase was reduced in virulence compared to any single or double mutants, suggesting an interplay of three U. maydis enzymes in suppressing SA pathway. By performing immunoprecipitation (IP) of Cmu1 from infected leave tissues followed by mass spectrometry, the maize protein Cmi1 (Cmu1 interactor 1) could be identified as an interactor. In vitro pull-down experiments confirmed the interaction between Cmu1 and Cmi1. Recombinant Cmi1 inhibited the chorismate mutase activity of Cmu1. The expression of cmi1 is strongly induced upon the infection of U. maydis, indicating that it is likely a pathogenesis related (PR) protein. Hydrogen-Deuterium exchange mass spectrometry (HDX/MS) mapped the interaction interface between Cmu1 and Cmi1, which involved the loop region of Cmu1. Truncation of the loop in Cmu1, which abolished the interaction of Cmu1 with Cmi1, showed only partial complementation of CL13Δcmu1 mutants, suggesting that the interaction between Cmu1 and Cmi1 may be relevant for the virulence of U. maydis

Sensing and degradation of the plant defence hormone salicylic acid by the biotrophic fungus Ustilago maydis

Salicylic acid (SA) belongs to the class of phenolic compounds and is composed of an aromatic ring with one carboxyl- and one hydroxyl group. In plants, it is a key signalling molecule for the regulation of local and systemic defence responses against biotrophic plant pathogens. One model organism to study biotrophic pathogens is Ustilago maydis, the causative agent of corn smut disease. U. maydis employs strategies to interfere with SA production and SA-associated signalling of its host Zea mays. These strategies are considered to supress defence responses and thereby contribute to a successful infection. Moreover, the U. maydis genome encodes three putative salicylate hydroxylases, UMAG_05230, UMAG_03408, and UMAG_05967, which are predicted to degrade SA. For one of these proteins, UMAG_05230 (Shy1), salicylate hydroxylase activity could already be experimentally confirmed. Based on the predicted enzymatic function of these proteins, it was hypothesized that by eliminating SA they could contribute to the suppression of host immunity. To provide insights into the biological role of SA degradation by salicylate hydroxylases in U. maydis, the functional characterization of these genes was continued in this study. It could be demonstrated that U. maydis is able to use SA as carbon source and that Shy1 is essential for SA utilization. Besides shy1 and the second salicylate hydroxylase-related gene UMAG_03408, which were previously shown to be induced during infection, also the third gene of this family, UMAG_05967, was strongly upregulated in these developmental stages. However, although induced during biotrophic growth, no involvement in virulence could be shown for these three genes. Transcriptional profiling revealed that shy1 and the two salicylate hydroxylase-related genes are induced in presence of SA, indicating that U. maydis is able to sense SA. To provide insights into the molecular mechanism of SA perception and signalling, a forward genetic screen was performed. This screen led to the identification of one key regulator for SA sensing, the binuclear zinc cluster transcription factor Rss1. Rss1 is important for SA sensing and modulates the expression of genes that are needed to metabolise SA and tryptophan. Rss1 most likely acts concomitantly as SA sensor and transcriptional activator. Although Rss1 is important for the regulation of SA-responsive genes in axenic culture, transcriptional profiling data provided evidence that additional cues and pathways could exist that regulate these genes during plant colonization. Moreover, virulence assays with rss1 deletion mutants showed that the deletion of rss1 had no impact on virulence in seedling infections

Funktionelle Charakterisierung eines LysM-Proteins von Ustilago maydis

Ustilago maydis, der Erreger des Maisbeulenbrandes, ist für die Etablierung einer kompatiblen Interaktion mit seiner Wirtspflanze Zea mays auf die Sekretion zahlreicher Effektorproteine angewiesen. Zu solchen Effektoren gehören sekretierte LysM-Proteine phytopathogener Pilze. LysM-Proteine können essentielle Virulenzfaktoren sein, indem sie Chito-Oligosaccharide, welche durch pflanzliche Chitinasen aus der pilzlichen Zellwand freigesetzt wurden, abfangen und dadurch eine PAMP-vermittelte Resistenz der Pflanze unterdrücken. Im Genom von U. maydis wurde ein für ein LysM-Protein kodierendes Gen (um11464) identifiziert und näher untersucht. Die Deletion von um11464 führte zu einem hypervirulenten Phänotyp in Pflanze. Eine detaillierte phänotypische Charakterisierung eines um11464 Deletionsstammes ergab, dass dieser eine veränderte Morphologie in Flüssigkultur sowie eine erhöhte Sensitivität gegenüber Zellwandstressoren aufwies. Ferner wirkte sich die Deletion von um11464 positiv auf die Filament- und Appressorienbildung aus. Die Penetrationseffizienz des Stammes SG200∆um11464 war hingegen im Vergleich zu SG200 unverändert. Sekretionsanalysen zeigten, dass das Signalpeptid von Um11464 funktionell war. Um11464 konnte jedoch zu keinem Zeitpunkt in Kulturüberständen nachgewiesen werden. Durch konfokale Laserscanning-Mikroskopie und Immunmarkierungen wurde gezeigt, dass das Protein in der pilzlichen Zellwand lokalisiert. Es wurde eine C-terminale Verankerung über nicht-kovalente Verknüpfungen nachgewiesen. Eine Interaktion mit Chitin oder anderen pilzlichen Zellwandbestandteilen konnte durch Polysaccharid-Bindeversuche mit rekombinantem Um11464 nicht bestätigt werden. Der positive Effekt der um11464 Deletion auf die Differenzierungsprozesse vor der Penetration sowie die Virulenz von U. maydis könnte andeuten, dass Um11464 eine veränderte Pflanzenreaktion hervorruft. Um dies zu untersuchen, wurden vergleichende Mais-Transkriptomanalysen durchgeführt. Diese zeigten, dass eine Vielzahl abwehrinduzierter Pflanzengene, darunter einige Transkriptionsfaktoren, spezifisch nach Infektion mit der um11464 Deletionsmutante herunterreguliert wurden, was eine aktive Unterdrückung der pflanzlichen Abwehr bedeuten könnte

Identifizierung von Pflanzensignalen, die Differenzierung von Ustilago maydis auf der Blattoberfläche induzieren

Das Maispathogen Ustilago maydis kann nach Fusion zweier haploider Zellen kompatiblen Paarungstyps seine pathogene Entwicklung initiieren und ein Dikaryon bilden. Die Zell-Zell Erkennung beruht auf einem Pheromon/Rezeptor System. Das Pheromon-Signal wird durch ein MAP-Kinase Modul übertragen, was zur Aktivierung von Prf1 führt, einem essentiellen Regulator von sexueller und pathogener Entwicklung. Auf der Oberfläche von Zea mays wächst das Dikaryon filamentös, differenziert ein Appressorium und penetriert die Wirtspflanze. In dieser Arbeit wurden die Pflanzensignale, die für Filamentbildung und Differenzierung von Appressorien benötigt werden, charakterisiert. Mittels eines solopathogenen Stammes konnte gezeigt werden, dass unter in vitro Bedingungen Hydroxy-Fettsäuren die Filamentbildung durch Induktion der Pheromon-Genexpression stimulierten. Dieses Signal aktiviert das MAP-Kinase Modul. Die beobachteten Filamente waren morphologisch ununterscheidbar Konjugationshyphen. Kontakt zu einer hydrophoben Oberfläche induzierte ebenfalls Filamentbildung und diese Filamente ähnelten dem filamentösen Dikaryon auf der Blattoberfläche. Es konnte gezeigt werden, dass die Integration beider Pflanzensignale das MAP-Kinase Modul, die Anwesenheit der MAPK Crk1 sowie des Transkriptionsfaktors Prf1 voraussetzt. Mit Hilfe eines Markergens, das spezifisch in der Spitzenzelle von Filamenten exprimiert wird, die ein Appressorium differenzieren, konnte gezeigt werden, dass Hydrophobizität in vitro essentiell für die Appressorienbildung war. Hydroxy-Fettsäuren wirkten auf hydrophober Oberfläche induzierend auf die Frequenz der Appressorienbildung. Diese Ergebnisse zeigen, dass die frühe Phase der Kommunikation zwischen U. maydis und seiner Wirtspflanze Mais über Integration von zwei distinkten Stimuli erfolgt. Um zu untersuchen, welche Gene nach Kontakt mit hydrophober Oberfläche und Hydroxy-Fettsäure induziert werden, wurden Transkriptom-Analysen mittels des in vitro Systems durchgeführt. Ein signifikanter Anteil der induzierten Gene kodierte für putativ sekretierte Proteine, darunter einige mit Funktionen in der pilzlichen Zellwandmodifikation, Komponenten der Zellwand, Proteine mit enzymatischer Funktion und Proteine ohne Homologie zu bekannten Proteinen. Letztere stellen möglicherweise Effektoren für die Interaktion mit dem Wirt dar. Diese Ergebnisse zeigen, dass bereits während der pilzlichen Entwicklung auf der Pflanzenoberfläche ein molekularer Dialog zwischen U.maydis und seinem Wirt initiiert wird

Biochemical and molecular analyses of the biosynthesis pathway of the indole derivatives in Piriformospora indica

The mutualistic root endophyte Piriformospora indica has the ability to colonize a wide range of plants including the monocot barley (Hordeum vulgare) and the dicot model plant Arabidopsis thaliana. The colonization of both, Arabidopsis and barley is characterized by a biphasic colonization strategy with an initial biotrophic interaction followed by a cell death associated phase. During both phases fungal inter- and intracellular growth is restricted to the root cortex cells and can never be observed in the endodermis or the central cylinder. The colonization of root cells by P. indica is often associated with beneficial effects to the host, such as growth promotion and changes in root morphology. The broad host range and the widely conferred benefits to the hosts suggest that the beneficial outcome could be based on general mechanisms and signaling pathways common to many different plant species. One such mechanism could be the recruitment of phytohormone pathways by P. indica. Beside their function in plant developmental processes, phytohormones were recently described to be involved in plant defence responses. Secretion of indole-3-acetic acid (IAA) by P. indica into the growth medium has already been reported. In this PhD study a tryptophan dependent IAA production pathway was identified in P. indica using biochemical and molecular methods. The main goals were focused on the functional analyses of the P. indica tryptophan dependent IAA pathway and how this may affect compatibility during the biotrophic interaction between P. indica and barley roots. For this, suitable molecular tools such as a PEG-mediated genetic transformation, a GFP reporter and an RNAi-mediated silencing system were established or optimized for use in P. indica. Time course transcriptional analyses after exposure to tryptophan designated the tryptophan aminotransferase piTam1 gene as the top candidate gene involved in the production of IAA in P. indica. A green fluorescence protein (GFP) reporter study and transcriptional analysis of colonized barley roots showed that piTam1 is induced during the biotrophic phase. Via an RNAi-mediated gene silencing piTam1 was identified as a key gene involved in the first step of auxin biosynthesis. RNAi transformants impaired in auxin production were characterized by a less compact colony growth phenotype and differences in their ability to utilize indole-3-acetaldehyde (IAD). Additionally, silencing of the piTam1 gene resulted in a reduced P. indica colonization of barley roots at 3 days after inoculation (dai) but the elicitation of growth promotion was not affected compared with barley colonized by the P. indica wild-type strain. Consistently an increased amount of free IAA and free indole-3-lactate (ILA), a byproduct of P. indica IAA biosynthesis pathway, could be detected in P. indica colonized barley roots compared to non colonized control plants at this time point Given the large amount of IAA detected in planta at 3 dai and the amount of IAA produced by P. indica in culture after tryptophan induction, it is unlikely that the differences in free IAA levels observed in planta are merely derived from fungal IAA. This suggests a local accumulation of both fungal and plant IAA during the initial biotrophic phase and is consistent with changes in IAA signaling and biosynthesis observed in barley transcriptome at this time point

Charakterisierung von frühen Komponenten der Signaltransduktion in Ustilago maydis

In U. maydis ist die Zell-Zellerkennung über ein Pheromon-Rezeptor-System essentiell für die pathogene Entwicklung. Nach Pheromonstimulation werden ein cAMP-Signalweg und eine MAPK-Kaskade aktiviert, jedoch ist der genaue Mechanismus der Signalübermittlung von dem Pheromonrezeptor Pra ins Zellinnere unbekannt. In Analogie zu anderen Pilzen wurde postuliert, dass ein G-Protein als Signalübermittler fungiert. In U. maydis wurden vier Ga-Untereinheiten gpa1-gpa4 identifiziert, aber nur Gpa3 konnte bisher eine Funktion im cAMP-Signalweg zugeordnet werden. Es blieb ungeklärt, ob die restlichen Ga-Untereinheiten untereinander und zu Gpa3 funktionell redundant sind. In dieser Arbeit wurde der C-Terminus des Rezeptors Pra als wichtiger Bereich für die Signalweiterleitung identifiziert. Zellen, die ein C-terminal deletiertes Rezeptorprotein exprimieren, können nach Pheromonstimulation keine Konjugationshyphen ausbilden, sind jedoch noch in der Lage mit Wildtypzellen zu fusionieren und dikaryotische Filamente zu bilden. Dieser Defekt konnte auf eine fehlende Stimulation der MAPK-Kaskade eingegrenzt werden und deutet darauf hin, dass die MAPK-Kaskade über eine mit dem Pra1-C-Terminus interagierende Komponente aktiviert wird. Die funktionelle Redundanz der Ga-Untereinheiten wurde anhand von Stämmen untersucht, die nur Gpa3 oder keine funktionelle Ga-Untereinheit exprimieren. gpa1 gpa2 gpa4-Dreifachdeletionsmutanten zeigten eine wildtypartige Pheromonantwort und eine vollständige pathogene Entwicklung, jedoch reduzierte Sporenbildung. Die Ga-Untereinheiten Gpa1, Gpa2 und Gpa4 sind demnach im Lebenszyklus von U. maydis nicht essentiell. Ga-Nullmutanten zeigten phänotypisch keinen Unterschied zu gpa3-Einzeldeletionsmutanten und waren cAMP-revertierbar. In Bezug auf die Pheromonantwort wird demnach nur Gpa3 benötigt. Die cAMP-revertierbaren Phänotypen konnten auf die Appressorienbildung und Penetration erweitert werden. Dabei wurde erstmals die Bildung von „knospenden Filamenten" beschrieben, die auf der Pflanzenoberfläche und anderen hydrophoben Oberflächen auftritt. Die Pathogenität war durch cAMP-Zugabe nicht revertierbar, was zeigt, dass die Signalgebung durch Gpa3 für die Tumorentwicklung benötigt wird. Gpa3 ist somit die zentrale regulatorische Ga-Untereinheit im Lebenszyklus von U. maydis und funktionell nicht durch eine andere Ga-Untereinheit ersetzbar. Microarray-Analysen zeigten, dass in der Dreifachdeletionsmutante die Basalexpression weniger Gene der Pheromonantwort und des Metabolismus reduziert war, was die Pheromonantwort aber nicht beeinträchtigte. In der Transkriptomanalyse der gpa3-Deletionsmutante wurden insgesamt 163 im Vergleich zum Wildtypstamm differenziell exprimierte Gene identifiziert. Die Analyse dieser Gene ergab, dass Gpa3 den Nährstoffstatus der Zelle abbildet und an der Glucoserepression beteiligt ist. Das deutlich unterschiedliche Expressionsprofil im Vergleich zur Dreifachdeletionsmutante bestätigte die funktionell nicht-redundante Funktion von Gpa3