Novel conditional mouse models for targeted kidney research : Emphasis on the analysis of the biological function of nephrin

Nephrin is a transmembrane protein belonging to the immunoglobulin superfamily and is expressed primarily in the podocytes, which are highly differentiated epithelial cells needed for primary urine formation in the kidney. Mutations leading to nephrin loss abrogate podocyte morphology, and result in massive protein loss into urine and consequent early death in humans carrying specific mutations in this gene. The disease phenotype is closely replicated in respective mouse models. The purpose of this thesis was to generate novel inducible mouse-lines, which allow targeted gene deletion in a time and tissue-specific manner. A proof of principle model for succesful gene therapy for this disease was generated, which allowed podocyte specific transgene replacement to rescue gene deficient mice from perinatal lethality. Furthermore, the phenotypic consequences of nephrin restoration in the kidney and nephrin deficiency in the testis, brain and pancreas in rescued mice were investigated. A novel podocyte-specific construct was achieved by using standard cloning techniques to provide an inducible tool for in vitro and in vivo gene targeting. Using modified constructs and microinjection procedures two novel transgenic mouse-lines were generated. First, a mouse-line with doxycycline inducible expression of Cre recombinase that allows podocyte-specific gene deletion was generated. Second, a mouse-line with doxycycline inducible expression of rat nephrin, which allows podocyte-specific nephrin over-expression was made. Furthermore, it was possible to rescue nephrin deficient mice from perinatal lethality by cross-breeding them with a mouse-line with inducible rat nephrin expression that restored the missing endogenous nephrin only in the kidney after doxycycline treatment. The rescued mice were smaller, infertile, showed genital malformations and developed distinct histological abnormalities in the kidney with an altered molecular composition of the podocytes. Histological changes were also found in the testis, cerebellum and pancreas. The expression of another molecule with limited tissue expression, densin, was localized to the plasma membranes of Sertoli cells in the testis by immunofluorescence staining. Densin may be an essential adherens junction protein between Sertoli cells and developing germ cells and these junctions share similar protein assembly with kidney podocytes. This single, binary conditional construct serves as a cost- and time-efficient tool to increase the understanding of podocyte-specific key proteins in health and disease. The results verified a tightly controlled inducible podocyte-specific transgene expression in vitro and in vivo as expected. These novel mouse-lines with doxycycline inducible Cre recombinase and with rat nephrin expression will be useful for conditional gene targeting of essential podocyte proteins and to study in detail their functions in the adult mice. This is important for future diagnostic and pharmacologic development platforms.Munuaissairaudet ovat viime vuosikymmenen aikana lisääntyneet räjähdysmäisesti. Erityisesti aikuisiän sokeritauti, johon liittyy insuliinin puute tai insuliinin vaikutusten heikkeneminen, on merkittävä syy valkuaisvirtsaisuuden ja munuaisten vajaatoiminnan kehittymiseen. Kansaintaloudellisesti näiden potilaiden hoito on hyvin merkittävä kustannus terveydenhoidolle kaikissa länsimaissa. Munuaiskerästen epiteelisolujen, podosyyttien, jotka ovat merkittäviä munuaisten suodostoiminnan kannalta, on osoitettu olevan keskeisiä sokeritautiin ja perinnöllisiin munuaistauteihin liittyvässä valkuaisvirtsaisuudessa. Podosyyttien ja niissä ilmentyvien rakennevalkuaisten roolia taudissa ei vielä tunneta riittävästi. Tämän väitösutkimuksen tarkoituksena oli tuottaa ja tutkia uusia muuntogeenisiä hiirimalleja podosyyttien perustoiminnan ja munuaisperäisten sairauksien syntymekanismien tutkimista varten. Munuaisen suodatuskalvoston toimintaan osallistuvia proteiineja on löydetty ja tutkittu laajasti. Useiden niistä tiedetään osallistuvan perinnöllisten munuaissairauksien syntyyn sekä liittyvän läheisesti sokeritaudissa syntyvään munuaisen suodatuskyvyn heikentymiseen. Lisäksi yhden tärkeimmän suodatuskalvon rakennevalkuaisista, nefriinin, on havaittu ilmentyvän myös muissa kudoksissa kuten kiveksissä, aivoissa ja haimassa. Suodatuskalvoston proteiinien toimintaa aikuisella eläimellä ja muissa kudoksissa on ollut vaikea tutkia johtuen poistogeenisten eläinten sikiönaikaisesta kuolevuudesta, joka johtuu munuasiperäisistä syistä. Tämän tutkimuksen tarkoituksena on ollut suunnitella ja toteuttaa hiirimalleja, joilla nefriinin ilmentyminen voidaan lopettaa aikuisella hiirellä haluttuna ajankohtana ja/tai halutussa kudoksessa. Väitöskirjatutkimuksessa suunnittelimme geneettisen työkalun, jonka avulla pystyimme ilmentämään haluttua geenituotetta ainoastaan podosyyteissä doksisykliini-antibiootin annostelun avulla. Siirtämällä tämä vektori hiiren perimään mikro-injektiotekniikan avulla tuotimme kaksi erilaista hiirikantaa. Ensimmäisessä kannassa pystyimme ilmentään Cre-rekombinaasigeeniä hiiren munuaisissa, jonka avulla voimme myöhemmin poistaa haluttuja geenejä ainoastaan podosyyteissä doksisyklliinin avulla haluttuna ajankohtana. Toisessa tuottamassamme kannassa pystymme tuottamaan rotan nefriiniä niinikään edellä mainitulla tavalla tarkasti kohdesolussa. Pariuttamalla tämän hiiren nefriinin suhteen poistogeenisen hiirikannan kanssa saimme luotua uuden hiirikannan. Saadut poikaset pysyivät elossa rotalta peräisin podosyyteissä ilmentyvän siirtogeenin avulla, mutta niiltä puuttui nefriinin ilmentyminen muissa kudoksissa. Tulokset osoittivat, että nefriinillä on myös tärkeä tehtävä hiiren muissa kudoksissa kuten kiveksissä, aivoissa ja haimassa. Tämän lisäksi havaitsimme uuden munuaisissa ilmentyvän geenin, densiinin, ilmentyvän myös hiiren kiveksessä. Nämä uudet hiirimallit mahdollistavat nefriinin yksityiskohtaisemman toiminnan sekä siihen liittyvien muiden proteiinien tutkimisen. Lisäksi geenien toiminnan lisääminen tai vähentäminen aikuisella eläimellä tai ainoastaan halutussa kohdekudoksessa mahdollistaa uusien lääkeaineiden vaikutuskohtien tunnistamisen alkuperäissairautta muistuttavassa fysiologisessa tilassa, joka helpottaa uusien hoitomuotojen prekliinistä suunnittelua

Early pregnancy serum IGFBP-1 relates to lipid profile in overweight and obese women

Correction: Volume: 6 Issue: 10 Article Number: e05248 DOI: 10.1016/j.heliyon.2020.e05248Lower level of insulin-like growth factor-binding protein (IGFBP-1) has been observed in insulin resistance, while higher level of matrix metalloproteinase-8 (MMP-8) has been linked to obesity. The aim here was to study in overweight and obese women, typically manifesting with insulin resistance, whether IGFBP-1 and MMP-8 are related to and reflect systemic low-grade inflammation, metabolism and diet. Fasting serum from overweight and obese pregnant women (n = 100) in early pregnancy were analysed for IGFBP-1, phosphorylated IGFBP-1 (phIGFBP-1) and MMP-8. High-sensitivity CRP and GlycA were used as markers for low grade inflammation. GlycA and lipids were quantified using NMR. IGFBP-1 associated negatively with GlycA, evidenced by higher concentrations in the lowest quartile (median 1.53 (IQR 1.45-1.72)) compared to the highest (1.46 (1.39-1.55)) (P = 0.03). Several lipid metabolites, particularly HDL-cholesterol, correlated inversely with phIGFBP-1 (FDRPeer reviewe

Metformin and insulin treatment of gestational diabetes: effects on inflammatory markers and IGF-binding protein-1 – secondary analysis of a randomized controlled trial

Abstract Background Gestational diabetes mellitus (GDM) is characterized by disturbed glucose metabolism and activation of low-grade inflammation. We studied whether metformin treatment has favorable or unfavorable effects on inflammatory markers and insulin-like growth factor-binding protein 1 (IGFBP-1) in GDM patients compared with insulin, and whether these markers associate with major maternal or fetal clinical outcomes. Methods This is a secondary analysis of a previous randomized controlled trial comparing metformin (n = 110) and insulin (n = 107) treatment of GDM. Fasting serum samples were collected at the time of diagnosis (baseline, mean 30 gestational weeks [gw]) and at 36 gw. Inflammatory markers serum high-sensitivity CRP (hsCRP), interleukin-6 (IL-6), matrix metalloproteinase-8 (MMP-8) and glycoprotein acetylation (GlycA) as well as three IGFBP-1 phosphoisoform concentrations were determined. Results In the metformin and insulin groups combined, hsCRP decreased (p = 0.01), whereas IL-6 (p = 0.002), GlycA (p < 0.0001) and all IGFBP-1 phosphoisoforms (p < 0.0001) increased from baseline to 36 gw. GlycA (p = 0.02) and non-phosphorylated IGFBP-1 (p = 0.008) increased more in patients treated with metformin than those treated with insulin. Inflammatory markers did not clearly associate with pregnancy outcomes but non-phosphorylated IGFBP-1 was inversely associated with gestational weight gain. Conclusions Metformin had beneficial effects on maternal serum IGFBP-1 concentrations compared to insulin, as increased IGFBP-1 related to lower total and late pregnancy maternal weight gain. GlycA increased more during metformin treatment compared to insulin. The significance of this observation needs to be more profoundly examined in further studies. There were no evident clinically relevant relations between inflammatory markers and pregnancy outcome measures. Trial registration The trial comparing metformin and insulin treatment was registered in ClinicalTrials.gov ( NCT01240785 ) November 3, 2010. Retrospectively registered