Amino acids effect on cell longevity in Saccharomyces cerevisiae : study of the signaling pathways involved

El envejecimiento se caracteriza por una pérdida progresiva de la integridad fisiológica que impide la función y aumenta la vulnerabilidad a la muerte. Este deterioro es el factor de riesgo primario en diversas patologías humanas como cáncer, diabetes, desórdenes cardiovasculares y enfermedades neurodegenerativas. La investigación acerca del envejecimiento ha logrado avances sin precedentes en los últimos años, fundamentalmente por el descubrimiento de que la velocidad de envejecimiento es controlada, al menos en parte, por caminos genéticos y procesos bioquímicos conservados a lo largo de la evolución. Diferentes aspectos característicos del envejecimiento son objeto de estudio en distintos organismos modelo: inestabilidad genómica, acortamiento de telómeros, alteraciones epigenéticas, agotamiento de células madre, disfunción mitocondrial, senescencia celular, comunicación intercelular y sensado desregulado de nutrientes. La levadura Saccharomyces cerevisiae es ampliamente utilizada como modelo para estudiar los mecanismos genéticos y moleculares de la longevidad. En este organismo se definen dos tipos de envejecimiento: replicativo y cronológico. El envejecimiento replicativo (en inglés, Replicative Life Span: RLS) se define como el número máximo de células hijas que una célula madre puede producir, mientras que el envejecimiento cronológico (en inglés, Chronological Life Span: CLS) se define como el periodo de tiempo en que una célula que no se está dividiendo permanece viable. Estos dos tipos de envejecimiento en levaduras tienen sus contrapartes en células de mamiferos: RLS se puede comparar con el envejecimiento de células mitóticamente activas y CLS se puede comparar con el envejecimiento de células en estado post-mitótico tales como neuronas o células de músculo. La restricción dietaria, que equivale a un ayuno de nutrientes sin llegar a producir malnutrición, es la única intervención conocida que enlentece el envejecimiento y extiende la vida y se la ha asociado a la regulación negativa de los sistemas conservados de señalización dependientes de nutrientes TORC1 y Ras-PKA. Si bien se han propuesto distintas hipótesis acerca de cómo la restricción dietaria modula el envejecimiento, el mecanismo aún no se ha establecido. El propósito de este proyecto fue estudiar los mecanismos moleculares involucrados en el proceso del envejecimiento de células de S. cerevisiae. Se analizó el efecto de los aminoácidos sobre la longevidad cronológica (CLS) en levaduras prototróficas y se determinaron qué vías de transducción de señales se encuentran involucradas en ese proceso. En particular, nos enfocamos en las vías TORC1, SPS (Ssy1-Ptr3-Ssy5) (sistema de sensado de aminoácidos) y la de control general de aminoácidos GAAC. Las vías GAAC y TORC1 coordinan la disponibilidad de nutrientes con la síntesis de proteínas, mientras que la vía SPS coordina la disponibilidad de aminoácidos a través de su incorporación al interior celular. Entre los procesos asociados al metabolismo de aminoácidos y a la longevidad analizamos el camino de respuesta a proteínas mal plegadas UPR (del inglés, Unfolded Protein Response), la tolerancia a un estrés por altas temperaturas y la activación de la autofagia. A través del conteo de unidades formadoras de colonias (UFC) a lo largo del tiempo, determinamos que el suplemento de aminoácidos tiene un efecto negativo sobre la longevidad en células wild type. Con la misma metodología, obtuvimos resultados donde determinamos que en ausencia de aminoácidos las proteínas Tor1 y Gln3 de la vía TORC1 tienen un efecto negativo sobre la longevidad, mientras que los factores de transcripción pertenecientes a la vía GAAC, Gcn4 y Leu3, son necesarios para el mantenimiento de la sobrevida en estas condiciones. En cambio, en presencia de aminoácidos, observamos que las mutantes de la vía SPS, que participan en la captación de aminoácidos extracelulares, logran aumentar su sobrevida con respecto a las células wild type. La presencia de aminoácidos también afecta la respuesta a distintos tipos de estrés. Observamos que la actividad UPR aumenta en presencia de aminoácidos. Determinamos que la misma se encuentra regulada tanto por la vía TORC1 como por la vía GAAC. Además, observamos que en presencia de aminoácidos la actividad UPR es menor en mutantes de la vía SPS que en células wild type. También encontramos que los aminoácidos producen un aumento en la tolerancia al estrés térmico y que la misma depende en parte de la vía TORC1 como también de la presencia del sensor Ssy1. Por otro lado, la presencia de aminoácidos solo interfiere con la activación de la autofagia luego de un ayuno de la fuente de nitrógeno. Además, la autofagia se encuentra regulada tanto por la vía TORC1 como la vía GAAC. Los altos niveles de autofagia observados durante la fase estacionaria en cepas deficientes en Tor1 y Gln3, podrían explicar en parte el fenotipo longevo de las mutantes. Mediante un análisis global del proteoma de células deficientes en el factor de transcripción Gcn4, efector principal de la vía GAAC, encontramos grupos de proteínas de expresión diferencial que participan tanto en el metabolismo celular como en la respuesta a varios tipos de estrés. Encontramos distintas enzimas sub-representadas involucradas en vías de biosíntesis para aminoácidos. Por otro lado, encontramos sobre-representadas varias proteínas relacionadas con el metabolismo del carbono, como la degradación del glucógeno y enzimas que participan en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Además analizamos el contenido relativo de aminoácidos entre células gcn4Δ y wild type mediante espectroscopía RMN y detectamos que varios aminoácidos se encuentran en menor contenido relativo en las células mutantes. También determinamos la cantidad de glucógeno y trehalosa en células crecidas hasta fase estacionaria. El conjunto de los resultados indica que la ausencia de Gcn4 produce una pérdida de la homeostasis que influye sobre el flujo de carbono dentro de la célula, produciendo una disminución en el almacenamiento de carbohidratos de reserva y un aumento en la actividad mitocondrial, lo que en última instancia impactará sobre la longevidad. En conjunto nuestros resultados indican que el metabolismo de los aminoácidos tiene un impacto directo sobre la longevidad cronológica la cual se encuentra regulada por las vías de señalización estudiadas. Además estas vías de señalización participan en la respuesta a distintos tipos de estrés lo que probablemente también impacte en el proceso de envejecimiento.Aging is characterized by a progressive loss of physiological integrity that impairs function and increases vulnerability to death. This deterioration is the primary risk factor in various human pathologies such as cancer, diabetes, cardiovascular disorders and neurodegenerative diseases. Research on aging has made unprecedented advances in recent years, primarily due to the discovery that the rate of aging is in part controlled by genetic pathways and biochemical processes conserved throughout evolution. Different characteristic aspects of aging are studied in different model organisms: genomic instability, telomere shortening, epigenetic alterations, stem cell depletion, mitochondrial dysfunction, cellular senescence, intercellular communication and deregulated nutrient sensing. The Saccharomyces cerevisiae yeast is widely used as a model to study the genetic and molecular mechanisms of longevity. There are two types of aging defined in this organism: replicative aging and chronological aging. Replicative lifespan (RLS) is defined as the maximum number of daughter cells that a mother cell can produce, while chronological lifespan (CLS) is defined as the period of time a cell that is not dividing remains viable. These two types of aging in yeast have their counterparts in mammalian cells: RLS can be compared with mitotically active aging cells and CLS can be compared to the aging of cells in the post-mitotic state such as neurons or muscle cells. Dietary restriction, which is equivalent to nutrient starvation without leading to malnutrition, is the only known intervention that slows aging and extends life and has been associated with downregulation of the conserved nutrient-dependent signaling systems TORC1 and Ras-PKA. Although different hypotheses have been proposed about how dietary restriction modulates aging, the mechanism has not yet been established. The purpose of this project was to study the molecular mechanisms involved in the aging process in S. cerevisiae cells. We analyzed the effect of amino acids on chronological longevity (CLS) of prototrophic yeasts and we determined the signal transduction pathways involved in this process. In particular, we focused on the TORC1, SPS (Ssy1-Ptr3-Ssy5) (amino acid sensing system) and GAAC (general amino acid control) pathways. The GAAC and TORC1 pathways coordinate nutrient availability with protein synthesis, while the SPS pathway coordinates amino acid availability through their incorporation into the cell. Among the processes associated with amino acid metabolism and longevity, we analyzed the UPR (Unfolded Protein Response) pathway, high-temperature stress tolerance, and autophagy activation. By counting colony-forming units (CFU) over time, we determined that amino acid supplementation has a negative effect on longevity. With the same methodology, we determined that in the absence of amino acids, Tor1 and Gln3 proteins of the TORC1 pathway have a negative effect on longevity, while the transcription factors belonging to the GAAC pathway, Gcn4 and Leu3, promote survival under these conditions. In contrast, in the presence of amino acids, we observed that SPS pathway mutants, which participate in extracellular amino acids uptake, manage to increase their survival compared to wild type cells. Amino acids also affects the response to different stresses. We observe that the UPR activity increases in the presence of amino acids. We determined that both the TORC1 pathway and the GAAC pathway regulate UPR. In addition, we observed that in the presence of amino acids, UPR activity is lower in mutants of the SPS pathway than in wild type cells. We also found that amino acids produce an increase in tolerance to heat stress and that it depends in part on the TORC1 and on the Ssy1 amino acids sensor. On the other hand, the presence of amino acids only interferes with the activation of autophagy after a nitrogen source starvation. Furthermore, both the TORC1 pathway and the GAAC pathway regulate autophagy. The high levels of autophagy observed during stationary phase of strains deficient in Tor1 and Gln3 could explain in part the long-lived phenotype of these mutants. Through a global proteome analysis of cells deficient in the transcription factor Gcn4, GAAC pathway main effector, we found that proteins differentially expressed were grouped by their participation in cellular metabolism and several stress responses. We found under-represented different enzymes involved in amino acid biosynthesis pathways. On the other hand, we found over-represented several proteins related to carbon metabolism, such as glycogen degradation and enzymes that participate in the TCA cycle. We also analyzed the relative content of amino acids between gcn4Δ and wild type cells by NMR spectroscopy and detected that several amino acids are in lower relative content in mutant cells. We also determined glycogen and trehalose amount in cells. All these results indicate that the lack of Gcn4 produces a loss of homeostasis and modifies the carbon flow within the cell, producing a decrease in the accumulation of storage carbohydrates and the increase in mitochondrial activity, which will ultimately affect longevity. Taken together, our results indicate that amino acids metabolism has a direct impact on chronological longevity, which is regulated by the signaling pathways studied. In addition, these signaling pathways participate in the response to different types of stress, which probably also impact on the aging process.Fil: Gulías, Juan Facundo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

Monitoring changes in the cellular content of biomolecules during ageing with FTIR spectroscopy

Dietary regimens have proven to promote longevity in several eukaryotic model organisms including the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. These interventions are effective strategies for preventing ageing and diseases and many of them are linked to amino acid and protein levels. The aim of this work was to better understand how the age-related TOR1 and SCH9 genes and the presence of amino acids affect cell metabolomes and to establish their impact on the ageing process. Cellular metabolic profiles were determined by FTIR spectroscopy. We demonstrated that metabolic signatures of cells deficient in SCH9, the major TORC1 effector, were very different to those of wild type and TOR1 deficient cells. In cells lacking Sch9 we also observed changes in other processes related to ageing such as endoplasmic reticulum stress and autophagy. We identified several anti-ageing biomarkers being the most relevant the intracellular content of pyruvate, glucose, ribose/deoxyribose associated compounds, and the presence of special protein conformational structures. The very sensitive FTIR technique allowed us to highlight important changes that occur along ageing in the metabolomes of the cells deficient in the key nutrient-sensitive Tor1-Sch9 pathway, even though slight differences on chronological lifespan were detected in our conditions